酶聯(lián)免疫吸附法與同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定GA的一致性研究*

黃云川 ,楊 琴 ,唐 敬 ,張 敏 ,任用坤△

四川省南充市中醫(yī)醫(yī)院:1.醫(yī)技科;2.檢驗(yàn)科,四川南充 637000

糖化清蛋白(GA)為清蛋白糖基化產(chǎn)物,是近年新發(fā)現(xiàn)的可用于確認(rèn)糖尿病患者治療中期效果的血糖監(jiān)測(cè)指標(biāo)。與傳統(tǒng)指標(biāo)糖化血紅蛋白(HbA1c)比較,GA 反映的是患者近3周內(nèi)血糖水平,且在血紅蛋白異常情況下其結(jié)果不受影響[1]。血清GA 水平測(cè)定方法主要有免疫層析法、高效液相色譜法、酶法等,不同方法參考區(qū)間存在較大差異,目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)公認(rèn)的參考測(cè)量方法。近年來(lái)日本臨床化學(xué)學(xué)會(huì)和日本糖尿病委員會(huì)指出,以JCCRM611作為GA 測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)物,同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(ID-LC/MS/MS)可作為GA的參考測(cè)量方法[2]。另外周慧娟等[3]對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)得出,ID-LC/MS/MS測(cè)定血清GA 水平準(zhǔn)確可靠。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是利用酶標(biāo)記抗原或抗體,從而檢測(cè)相應(yīng)抗原或抗體水平的檢測(cè)手段,相較于ID-LC/MS/MS,具有操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉等特點(diǎn),更利于臨床大規(guī)模篩查[4]。鑒于此,本研究擬對(duì)ELISA 和ID-LC/MS/MS檢測(cè)血清GA 水平性能進(jìn)行比較,旨在為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020年1-6月本院檢驗(yàn)科保留的體檢人群剩余血清300份作為研究標(biāo)本,-80 ℃保存?zhèn)溆谩＜{入標(biāo)準(zhǔn):(1)18 歲以上;(2)體檢合格。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)妊娠或哺乳期女性;(2)溶血、乳糜、黃疸血清標(biāo)本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 人GA ELISA 試劑盒(英國(guó)Abbexa公司)。Ultra PFPP色譜柱(北京邁瑞達(dá)科技有限公司)。七氟丁酸、乙腈(日本TCI公司)。Multiskan FC 型酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾公司)。TSQ VANTAGE型三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)賽默飛世爾公司)。

1.3 方法

1.3.1 ELISA 將抗體預(yù)包被至96孔板上,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配置標(biāo)準(zhǔn)品、測(cè)試樣品和生物素偶聯(lián)試劑,加至孔中孵育;加入結(jié)合了辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的試劑并孵育,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗;添加3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺,觀察到藍(lán)色產(chǎn)物時(shí),加入酸性終止液,Multiskan FC 型酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm 處吸光度(A)值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算GA 水平。

1.3.2 ID-LC/MS/MS (1)標(biāo)準(zhǔn)工作液及上機(jī)標(biāo)準(zhǔn)工作液制備:按比例將賴(lài)氨酸和同位素標(biāo)記賴(lài)氨酸、糖化賴(lài)氨酸和同位素標(biāo)記糖化賴(lài)氨酸混勻;不同摩爾比標(biāo)準(zhǔn)工作液與待測(cè)樣品混勻,依次進(jìn)行氫化還原反應(yīng)、強(qiáng)酸高溫水解反應(yīng)。(2)液相色譜條件:色譜柱為Ultra PFPP(柱長(zhǎng)2.1 mm,內(nèi)徑150 mm,粒徑3 μm),乙腈(90∶10)為流動(dòng)相A,水(含0.06%七氟丁酸)為流動(dòng)相B,等度洗脫,流速250 μL/min,進(jìn)樣量1 μL。(3)質(zhì)譜條件:TSQ VANTAGE型三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,電離氣壓3 998.65 V,離子源為電噴霧(ESI),噴霧氣體為氮?dú)?噴霧器壓力30 PSI,氣體流速10 L/min,離子源溫度200.42 ℃,掃描類(lèi)型MS2SRM,掃描范圍300～2 000 M/Z。(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)質(zhì)譜采集:工作模式為選擇反應(yīng)檢測(cè)掃描(SRM)模式,采集賴(lài)氨酸碎片離子峰84.2、67.1、56.2(147 M/Z),同位素標(biāo)記賴(lài)氨酸碎片離子峰88.2、70.2、56.2(151 M/Z),選擇兩種物質(zhì)在碎片離子峰56.2的峰面積比值作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),糖化賴(lài)氨酸碎片離子峰84.2、248.4、130.0(311 M/Z),同位素標(biāo)記糖化賴(lài)氨酸碎片離子峰84.2、270.1、189.1(317 M/Z),選擇兩種物質(zhì)在碎片離子峰84.2的峰面積比值作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn);ID-LC/MS/MS法測(cè)定GA水平單位為mmol/mol,根據(jù)公式將其轉(zhuǎn)化為酶法常用單位%,GA(%)=0.056 52×GA(mmol/mol)-0.042 17。

1.3.3 一致性評(píng)價(jià) 將兩種方法檢測(cè)結(jié)果分別按照各試劑提供的參考范圍和本研究初步評(píng)估建立的參考范圍上限為標(biāo)準(zhǔn),高于標(biāo)準(zhǔn)為陽(yáng)性,低于標(biāo)準(zhǔn)為陰性;采用Kappa一致性檢驗(yàn)評(píng)價(jià)兩種方法測(cè)定結(jié)果一致性,Kappa=(Po-Pe)/(1-Pe),Po為每一類(lèi)正確分類(lèi)的樣本數(shù)量之和除以總樣本數(shù),即實(shí)際一致率,Pe為理論一致率。

1.3.4 精密度評(píng)價(jià) 根據(jù)ELISA 測(cè)定值得到GA低、中、高水平樣本,將水平相近樣本混合制備血清GA 候選標(biāo)準(zhǔn)品,連續(xù)測(cè)定5 d,每天測(cè)定4次;計(jì)算兩個(gè)水平重復(fù)度和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度,分別用Sr和S1表示,確認(rèn)其精密度范圍是否與廠商標(biāo)注精密度符合,以基于生物學(xué)變異的精密度質(zhì)量規(guī)范(<2.6%)為質(zhì)量目標(biāo)[5],將測(cè)定的精密度與質(zhì)量目標(biāo)進(jìn)行比較,以確保試驗(yàn)結(jié)果可接受的醫(yī)學(xué)實(shí)用性。Sr=D 為測(cè)試總天數(shù),n為每天重復(fù)次數(shù),Xdi為第d天第i次測(cè)定結(jié)果。

1.3.5 正確度評(píng)價(jià) ELISA 法測(cè)定3個(gè)水平GA 標(biāo)準(zhǔn)物(JCCRM611-1HH),由同位素稀釋質(zhì)譜法(ID/MS)賦值,認(rèn)證值為31.1%;計(jì)算測(cè)定值與認(rèn)定值的相對(duì)偏差,正確度(%)=(測(cè)定值-認(rèn)證值)/認(rèn)證值×100%,以小于1/2允許總誤差(±5%)為判斷標(biāo)準(zhǔn)[6],確保試驗(yàn)結(jié)果正確度。

1.3.6 質(zhì)量控制 每個(gè)樣本連續(xù)測(cè)定3次,且在同一批內(nèi)完成測(cè)定,兩種檢測(cè)方法測(cè)定樣本在30 d內(nèi)完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Microsoft Excel2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料用M(P25,P75)表示。Passing-Bablok回歸計(jì)算兩種方法斜率、截距的95%置信區(qū)間(95%CI),Bland-Altman圖分析兩種方法平均偏差,以Kappa值作為兩種方法一致性評(píng)價(jià)結(jié)果,以Kappa值≥0.75表示兩者一致性較好,0.40～0.75表示兩者一致性一般,<0.40表示兩者一致性較差。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ID-LC/MS/MS測(cè)定血清GA 水平 血清GA水平檢測(cè)結(jié)果為偏態(tài)分布,ID-LC/MS/MS檢測(cè)血清GA 水平為18.73%(13.21%,22.48%)。

2.2 ELISA 測(cè)定血清GA 水平 檢測(cè)結(jié)果為偏態(tài)分布,ELISA 檢測(cè)血清GA 水平為15.36%(11.14%,18.78%)。

2.3 兩種方法檢測(cè)血清GA 水平的一致性評(píng)價(jià)Passing-Bablok回歸分析結(jié)果顯示,兩種方法檢測(cè)血清GA 水平的斜率和截距的95%CI分別為0.911～1.157,0.114～0.487,斜率的95%CI包含1,但截距的95%CI未包含0,見(jiàn)圖1。Bland-Altman圖顯示,兩種方法檢測(cè)血清GA 水平的差值均數(shù)為3.78%,低于臨床最低要求(4.5%),見(jiàn)圖2。兩種方法檢測(cè)血清GA 水平的一致性較高(Kappa=0.814)。

圖1 ID-LC/MS/MS和ELISA 測(cè)定血清GA 水平的Passing-Bablok回歸圖

圖2 ID-LC/MS/MS和ELISA 測(cè)定血清GA 水平的Bland-Altman圖

2.4 ELISA 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 精密度 ELISA 測(cè)定各樣品血清GA 水平變異系數(shù)(CV)均低于廠家提供近似水平標(biāo)準(zhǔn)品CV。見(jiàn)表1。

表1 精密度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.4.2 正確度 ELISA 測(cè)定各樣品血清GA 水平測(cè)定值與認(rèn)定值的相對(duì)偏差均小于1/2允許總誤差,在可接受范圍。見(jiàn)表2。

表2 正確度評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論

目前臨床GA 檢測(cè)方法尚無(wú)統(tǒng)一的參考標(biāo)準(zhǔn),因此,無(wú)法避免因采用單位或溯源性不同導(dǎo)致的結(jié)果差異較大[7-8]。近年來(lái)隨著液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展,LC/MS/MS 成為目前研究的熱點(diǎn)。而探索與IDLC/MS/MS一致性較高,且具有簡(jiǎn)便、高效、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法,對(duì)臨床大規(guī)模應(yīng)用具有重要意義[9]。ELISA 主要將蛋白、抗體或激素等直接或間接固定于固相載體,再加入一級(jí)檢測(cè)抗體形成抗原抗體復(fù)合物,從而檢測(cè)樣本中抗原水平,具有操作簡(jiǎn)便、價(jià)格較低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。有研究對(duì)比了LC/MS/MS和ELISA 性能發(fā)現(xiàn),兩者在檢測(cè)血清25-羥基維生素D水平上一致性較好,且以L(fǎng)C/MS/MS為“金標(biāo)準(zhǔn)”作為參考,ELISA 診斷維生素D 缺乏的靈敏度和特異度較 高[10]。ID-LC/MS/MS 是 在LC/MS/MS 基 礎(chǔ)上增加了同位素標(biāo)記技術(shù),具有更高的靈敏度和特異度[11]。任文華等[12]研究指出,ID-LC/MS/MS 測(cè)定血清GA 精密度高、正確性好,與常規(guī)酶法相關(guān)性較好,推薦作為我國(guó)測(cè)定GA的候選參考方法。但由于ID-LC/MS/MS對(duì)檢測(cè)設(shè)備及樣品質(zhì)量要求較高,操作費(fèi)時(shí),費(fèi)用較高,不利于基層醫(yī)院推廣和大規(guī)模篩查[13]。

本研究中,ELISA 采用的是英國(guó)Abbexa公司生產(chǎn)的GA 檢測(cè)試劑盒,結(jié)果顯示ELISA 檢測(cè)血清GA水平為15.36%(11.14%,18.78%),在ID-LC/MS/MS測(cè)定血清GA 水平[18.73%(13.21%,22.48%)]范圍內(nèi),提示ELISA 在血清GA 檢測(cè)中具有一定應(yīng)用價(jià)值;ELISA 檢測(cè)血清GA 水平與以往報(bào)道的結(jié)果[14-15]存在差異,分析原因與檢測(cè)系統(tǒng)、參考范圍等有關(guān)。一致性評(píng)價(jià)中,Passing-Bablok回歸分析顯示兩種方法檢測(cè)血清GA 水平斜率的95%CI包含1,但截距的95%CI未包含0,提示兩種方法間不存在系統(tǒng)和比例誤差,Bland-Altman圖顯示兩種方法檢測(cè)血清GA水平的平均偏差低于臨床最低要求(3.78%vs.4.5%),通過(guò)計(jì)算Kappa值發(fā)現(xiàn),兩種方法檢測(cè)血清GA水平的一致性較高,提示ELISA 有可能成為IDLC/MS/MS的有效替代方法。進(jìn)一步對(duì)ELISA 進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),ELISA測(cè)定各樣品血清GA 水平CV均低于廠家提供近似水平標(biāo)準(zhǔn)品CV,提示其符合基于生物學(xué)變異的精密度質(zhì)量規(guī)范;ELISA 法測(cè)定各樣品血清GA 水平測(cè)定值與認(rèn)定值的相對(duì)偏差均小于1/2允許總誤差,在可接受范圍內(nèi),提示其準(zhǔn)確度較高。

綜上所述,ELISA 與ID-LC/MS/MS 測(cè)定血清GA 具有良好一致性,均能滿(mǎn)足臨床要求,以ID-LC/MS/MS為參考,ELISA 具有良好的正確度和精密度,且操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用相對(duì)較低,可用于臨床大規(guī)模快速檢測(cè)。