miRNA-182與miRNA-187聯合檢測對前列腺癌診斷的價值*

史浩天 ,范學武 ,田 龍△ ,胡逸民

1.河北北方學院附屬第一醫院檢驗科,河北張家口 075000;2.河北省人民醫院心血管內科導管室,河北石家莊 050000;3.中國醫學科學院腫瘤醫院放療科,北京 100021

前列腺癌(PCa)粗發病率位居中國男性惡性腫瘤第6位,且仍在升高[1]。局限性或區域性擴散的PCa患者5年相對生存率可達100.0%,但存在遠端轉移的PCa患者僅為30.2%[2]。因此,早期篩查確診PCa并發現轉移灶將會極大改善患者預后,具有重要的臨床意義。

PCa早期篩查方法以血清前列腺特異性抗原(PSA)檢驗為主。PCa發病率隨著PSA 水平升高而升高[3-6]。然而一些良性病變,如前列腺增生(BPH)也會導致PSA 升高。因此,單獨檢測PSA 對PCa的診斷特異度較低。目前,生物基因組標志物已經開始應用于多種腫瘤的篩查和治療[7]。其中有關參與細胞轉錄后基因表達調控,長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子微小RNA(miRNA)相關研究較多。miRNA 可作為致癌基因或抑癌基因在PCa中異常表達,對PCa的發生、發展和轉移具有較大影響[8]。因此,在前列腺腫瘤組織,尿液和血清標本中檢測特定miRNA 表達水平可能對提高PCa診斷準確率具有重大意義,但目前相關研究較少。

為了明確miRNA 對PCa的診斷意義,本研究檢測了前列腺疾病患者前列腺影像學異常區域(IAA)組織中miRNA-182和miRNA-187表達水平并統計分析其與PCa各項臨床資料間的關系和對PCa的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河北北方學院附屬第一醫院2019年12月至2020年12月收治的33例PCa患者為試驗組。納入標準:(1)體質量指數在18～25 kg/m2;(2)患者接受多參數磁共振成像并確定IAA大小;(3)患者接受經直腸超聲引導穿刺活檢;(4)各項臨床資料完整。排除標準:(1)前列腺存在嚴重鈣化、肥大或感染;(2)合并直腸息肉或痔瘡;(3)接受過前列腺按摩;(4)接受過其他針對前列腺疾病的治療(手術、放化療、激素治療等)?；颊吣挲g52～73歲,平均(65.2±7.8)歲;年齡≥60歲患者26例,<60歲7例;6例為Gleason評分(GS評分)≤6分的高分化腺癌患者,7例為GS評分=7分的中分化腺癌患者,20例為GS評分≥8分的低分化腺癌患者;患者PSA水平在0～<10 ng/mL的有5例,10～<20 ng/mL的有7例,≥20 ng/mL的有21例;腫瘤分期在T1～T2期有14例,T3～T4期有19例;全身骨掃描發生遠端轉移患者17 例,未發生轉移者16 例;前列腺IAA≥1 cm 者9例,<1 cm 者24例。選取同期收治的前列腺增生(BPH)患者30例為對照組。本研究通過該院醫學倫理委員會批準(倫理編號:W2021)。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 Trizon Reagent試劑盒和低溫高速離心機均購自美國賽默飛世爾公司。逆轉錄試劑盒,實時熒光定量PCR 儀和試劑盒均購自日本Takara公司。生物組織研磨器購自法國Bertin 公司。miRNA-182、miRNA-187、U6逆轉錄引物、PCR 上下游引物均由美國Sigma生物科技公司提供,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 方法

1.3.1 IAA 組織標本的獲取 對所有患者進行經直腸超聲引導穿刺活檢,所有活檢標本取自多參數磁共振影像確定的IAA。將活檢標本置于研磨器中,Trizol充分裂解后加入氯仿進行離心。之后將上層水相抽至新的微量離心管中,加入同體積冷異丙醇以沉淀RNA。之后離心并丟棄上清液,使用75%預冷乙醇洗滌包含RNA的沉淀物,離心并丟棄上清液。最后,于RNA 提取試劑盒中加DEPC處理水溶解標本。采用紫外分光光度法檢測總RNA 濃度及純度,取吸光度比值為1.8～2.1的樣品用于后續試驗。

1.3.2 miRNA 表達水平的測定 以U6為內參,將樣本逆轉錄為cDNA,并利用SYBR Premix ExTaq熒光 定量PCR 試劑盒、miRNA-182/187 引物和SYBRGreen 熒光染料,嚴格按照試劑盒說明書進行操作,進行實時定量逆轉錄。通過RT-qPCR 曲線獲得熒光達到閾值的循環數,即Ct值,miRNA 相對表達水平計算公式為RQ=2-ΔΔCt。

1.4 統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析。不符合正態分布的計量資料采用M(P25,P75)表示,組間比較采用秩和檢驗。根據受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)評估miRNA 對PCa的診斷效能。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組miRNA 表達水平比較 試驗組IAA 組織中miRNA-182 表達水平明顯高于對照組(P=0.002);miRNA-187表達水平明顯低于對照組(P<0.001),見表2。

表2 兩組miRNA 表達水平的比較[M(P25,P75)]

2.2 PCa患者miRNA 表達水平與臨床資料的關系 結果顯示,PCa患者miRNA-182 表達水平與所有臨床資料無關;miRNA-187表達水平與血清PSA水平、遠端轉移、IAA 大小存在一定關系,PSA≥10 ng/mL、存在遠端轉移、IAA≥1 cm 時,miRNA-187表達水平明顯降低(P<0.05)。但miRNA-187表達水平與年齡、GS評分、臨床分期無關(P>0.05)。見表3。

表3 miRNA 表達水平與各臨床資料的關系[M(P25,P75)]

續表3 miRNA 表達水平與各臨床資料的關系[M(P25,P75)]

2.3 miRNA的診斷效能 單獨檢測miRNA-182診斷PCa的AUC 為0.638(95%CI:0.522～0.711,P<0.01);單獨檢測miRNA-187 診斷PCa的AUC為0.741(95%CI:0.652～0.799,P<0.01);miRNA-182與miRNA-187 聯合檢測診斷PCa的效能最高,AUC為0.822(95%CI:0.771～0.839,P<0.01)。

3 討論

miRNA 通過參與細胞轉錄后影響基因表達調控,即調節從DNA 到蛋白質的過程,影響細胞分化、增殖和凋亡等過程[9]。50%以上的miRNA 位點在腫瘤相關區域[10],其異常表達是腫瘤發生和進展的重要原因之一[11]。miRNA 對PCa的影響極為復雜,可分為表達水平升高而發揮“促癌”作用的miRNA-21、miRNA-34b等,以及表達水平降低而發揮“抑癌”作用的miRNA-15a、miRNA-206 等[12]。隨著研究進展,同PCa密切相關的miRNA 不斷被發現,其作用機制也逐漸清晰。

本研究發現,試驗組IAA 組織中miRNA-182表達水平明顯高于對照組(P=0.002);miRNA-187表達水平明顯低于對照組(P<0.001)。劉云等[13]研究發現,miRNA-182在PCa組織中的表達水平明顯高于癌旁組織,且在PCa 細胞系PC-3、LNCaP 和DU145中的表達均高于前列腺正常上皮細胞RWPE-1;miRNA-182可上調PCa細胞雄激素非依賴性生長,并通過干預多個抑癌基因表達來遲滯腫瘤細胞凋亡程序的啟動;成功下調miRNA-182表達后,PCa細胞的增殖能力明顯受到抑制,細胞凋亡能力明顯增強,FOXO1表達水平明顯升高,VEGF和p53的表達明顯降低,從而降低了“促癌”作用。HU 等[14]研究中發現miRNA-187在PCa組織中的表達明顯低于癌旁組織,而CD276表達水平明顯升高。miRNA-187通過誘導CD276抑制PCa細胞增殖、侵襲、遷移和血管生成,促進其凋亡。成功上調miRNA-187 表達后,CD276表達降低,JAK3-STAT3-Slug 信號通路受到抑制,從而降低了“抑癌”作用[15-16]。

本研究結果顯示,單獨檢測miRNA-182 診斷PCa的AUC 為0.638,單獨檢測miRNA-187 診斷PCa的AUC 為0.741,miRNA-182 與miRNA-187聯合檢測診斷PCa的效能最高,AUC 為0.822。鄭興明等[17]研究了miRNA-34b聯合PSA 檢測對PCa的診斷價值,結果顯示,聯合檢測的診斷價值最高。未來研究中可以聯合直腸指檢、經直腸超聲和多參數磁共振等臨床資料進行診斷,可能會進一步提高診斷效能。

綜上所述,IAA 組織中miRNA-182 和miRNA-187的聯合檢測對PCa診斷具有一定臨床價值,值得臨床推廣應用。