KCTD11對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響及分子機制

張 激 ,譚興民

四川省中西醫結合醫院:1.腫瘤科;2.婦科,四川成都 610041

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一,其發病率及病死率在女性惡性腫瘤中均高居第四位,僅2020年全球新增宮頸癌患者60余萬例,新增死亡患者30余萬例,且發病呈現年輕化趨勢[1]。研究表明人乳頭瘤病毒(HPV)的感染與多數宮頸癌病例的發生密切相關,但環境因素及基因突變均可能誘導宮頸癌的發生和發展[2-3]。近年來,基因異常表達與宮頸癌發生的關系正在成為臨床關注和研究的熱點,探討具有價值的宮頸癌治療靶點,對于臨床治療,提升女性健康具有十分重要的意義。

含鉀通道四聚結構域蛋白11(KCTD11)能夠參與多種細胞生理活動,如細胞轉移及凋亡等[4-5]。研究表明,KCTD11的表達與前列腺癌、肝癌及神經管細胞瘤的發生密切相關[6-7],但其在宮頸癌中的作用及機制尚不明確。本研究分析了KCTD11在宮頸癌中的表達情況,探討KCTD11對宮頸癌細胞增殖的影響及機制,旨在為宮頸癌的基因治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌HeLa 細胞與人胚腎細胞系HEK293FT 細胞購自中國醫學科學院。DMEM 培養基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶購自美國Gibco公司。細胞總RNA 提取試劑Trizol、反轉錄試劑盒及定量試劑購自日本Takara公司。MG132 購自MCE公司。KCTD11抗體及Tubulin抗體購自北京博奧森公司,Flag、Myc、CDK2、CDK4、CDK6、CCND3及CCNE2 抗體購自美國CST 公司。Myc、CDK2、CDK4、CDK6、CCND3、CCNE2、KCTD11 及GAPDH 定量引物購自華大基因。慢病毒包裝質粒pLP1、pLP2及VSVG,染色質免疫沉淀技術(ChIP)檢測試劑盒購自賽默飛生命科學公司。RIPA 裂解液、蛋白酶體抑制劑PMSF等常規生化試劑購自上海生工公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT 測定 取生長狀態良好的細胞,經過胰酶消化后添加培養基重新成懸,并利用細胞計數板進行計數處理后,將細胞加入96孔板,每孔1 000個細胞。放置培養箱中24 h后,每孔添加MTT 溶液25 μL,培養2 h后,移除培養基,每孔添加200 μL DMSO,水平搖床孵育10 min后,于560 nm 波長條件下測定各組細胞吸光度(A560),共測定7 d,繪制成生長曲線。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達 取所需測定細胞,經過胰酶消化,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后,收集細胞沉淀,并添加適量的含蛋白酶體抑制劑的RIPA裂解液,冰上裂解30 min后,離心收集上清液。利用BCA 試劑盒測定各組蛋白濃度,根據濃度計算上樣量,每組上樣50 μg蛋白。各組蛋白經高溫變性后,于10% PAGE 膠中進行電泳,并將蛋白轉印到PVDF膜上。使用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后,孵育一抗(4 ℃過夜),次日回收一抗,TBST 清洗后,室溫孵育二抗2 h。使用TBST 清洗,利用化學發光試劑檢測相關蛋白信號。

1.2.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 經胰酶消化,PBS清洗后的細胞沉淀,依據RNA 提取試劑盒步驟提取總RNA(默克生物,貨號:12183018A),經過質量檢測及濃度測定后,將其反轉為cDNA。后采用RT-qPCR 進行檢測,每組3 個復孔。引物序列見表1。

表1 定量引物序列

1.2.4 ChIP分析 過表達融合Flag標簽KCTD11蛋白的HeLa細胞經過1%甲醛溶液固定后,利用細胞刮刀收集細胞沉淀,并加入裂解液,于適合的超聲條件下,將其染色質打斷到200～1 000 bp。離心取上清液,并加入Flag抗體或IgG,4 ℃旋轉過夜。次日,加入磁珠,并依照試驗步驟,添加緩沖液進行清洗純化。清洗純化后的磁珠-抗體-染色質片段,經過剝離液處理后,利用核酸回收試劑盒進行純化回收后,利用Myc啟動子引物進行RT-qPCR,并分析試驗結果,具體試驗步驟參照碧云天ChIP 分析試劑盒,貨號:P2078。

1.2.5 細胞周期檢測 取各組細胞經過胰酶消化后,使用PBS清洗兩次,收集細胞沉淀。使用75%乙醇重新成懸細胞,直至完全成懸成單個細胞,放置于-20 ℃冰箱,固定24 h。固定完成后,離心收集細胞沉淀,使用預冷PBS清洗3次,用PBS重新成懸,加核糖核酸酶(RNAase)37 ℃處理30 min,加入500 μL PI常溫避光染色30 min,使用流式細胞儀分析各組細胞的細胞周期分布情況。

1.2.6 數據庫分析 本研究使用UALCAN 數據庫(網址:http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析KCTD11在宮頸癌中的表達及與宮頸癌分級間的關系,首先選定“TCGA analysis”欄,于“Enter gene symbol”中輸入“KCTD11”,在“TCGA dataset”中選定宮頸癌后,點擊“Explore”即可得到分析結果。

本研究使用GEPIA 2 數據庫(網址:http://gepia2.cancer-pku.cn/#survival)分 析KCTD11 與 細胞周期蛋白表達相關性,選擇“Expression analysis”中“Correlation analysis”,在gene欄中輸入需要分析的兩個基因名,腫瘤類型中選擇宮頸癌,并點擊“Plot”即可得到分析結果,根據數據庫進行分組,分為正常組織(n=3)和宮頸癌組織(n=305)。

1.2.7 短發夾RNA(shRNA)載體構建 取shRNA上游和下游各10 μL,設置一個對照(shNeg組)及兩個試驗組,即shKCTD11-1#組與shKCTD11-2#組,加入雙蒸水80 μL于1.5 mL 離心管中。另取燒杯,裝適量沸水,將離心管放置燒杯內,使其自然退火降溫。取退火shRNA 5 μL,酶切后加入PLKO.1載體1 μL,使用T4 連接酶系統室溫連接過夜后,轉化涂板,挑取單克隆進行測序。收到測序結果后,與shRNA 序列進行比對,選取100%匹配的菌株提取質粒,即得到構建好的shRNA 載體。

1.3 統計學處理 所有數據均采用SPSS20.0 和Graphpad Prism 5.0軟件進行分析。正態分布的計量資料以表示,多組間比較使用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KCTD11在宮頸癌中的表達 利用在線數據庫(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)比較KCTD11在宮頸癌組織和正常組織中的表達情況,結果表明KCTD11在宮頸癌組織中的表達水平顯著高于其在正常組織中的表達水平(P<0.05),見圖1。

圖1 KCTD11在宮頸癌中的表達分析

2.2 敲低KCTD11對宮頸癌細胞增殖情況的影響shKCTD11-1#組及shKCTD11-2#組細胞中KCTD11的mRNA 和蛋白表達水平顯著低于shNeg組(P<0.001),見圖2。與shNeg組相比,shKCTD11-1#組及shKCTD11-2#組細胞增殖能力顯著降低(P<0.001),見圖3。同時下調KCTD11,會導致細胞周期阻滯于G0/G1期(P<0.05),見圖3。

圖2 RT-qPCR 和Western blot檢測各組細胞中KCTD11的表達

圖3 KCTD11對宮頸癌細胞增殖的影響

2.3 KCTD11的表達與多種周期蛋白表達的關系 分析數據庫數據(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)發現,KCTD11的表達與原癌基因Myc及多種細胞周期蛋白(CDK2、CDK4、CDK6、CCND3及CCNE2)表達呈正相關,見圖4。

圖4 KCTD11與Myc、CDK2、CDK4、CDK6、CCND3和CCNE2表達量的關系

2.4 抑制KCTD11 對細胞周期蛋白表達水平的影響抑制 KCTD11 后,shKCTD11-1# 組及sh-KCTD11-2#組細胞中原癌基因Myc及多種細胞周期蛋白(CDK2、CDK4、CDK6、CCND3及CCNE2)的mRNA 及蛋白表達水平顯著低于shNeg 組(P<0.001),見圖5。

圖5 KCTD11對細胞周期相關蛋白表達的影響

2.5 KCTD11轉錄激活Myc 在宮頸癌細胞周過表達融合Flag標簽的KCTD11蛋白,利用Flag抗體進行ChIP 分析。結果表明,KCTD11能夠結合到原癌基因Myc的啟動子上,從而激活Myc的表達,見圖6。

圖6 KCTD11對Myc表達的影響

3 討論

KCTD11是KCTD 家族成員之一。KCTD 蛋白家族在細胞內,往往與Cullin3蛋白相互結合[8],參與基因的轉錄調控或泛素化調控過程,與多種腫瘤的發生和發展密切相關[9]。KCTD11作為該家族蛋白成員之一,早期研究主要著重于其與Hedgehog信號通路的關系,在細胞和生物體發育過程中發揮著十分重要的作用[10]。近年來,有研究表明KCTD11的表達與腫瘤的發生密切相關,如前列腺癌、肝癌及神經管細胞瘤等,并發現其能直接激活Hippo信號通路[6-7]。

本研究由分析KCTD11在宮頸癌中的表達及其與宮頸癌級別的關系入手,發現KCTD11在宮頸癌組織中表達顯著升高,KCTD11可能與宮頸癌的發展密切相關。為進一步探究KCTD11在宮頸癌中的作用,本研究在宮頸癌細胞中對KCTD11進行了敲低處理,結果表明敲低KCTD11能夠阻滯宮頸癌細胞的細胞周期,進而抑制宮頸癌細胞的增殖。分析數據庫數據發現,KCTD11的表達與包含原癌基因Myc在內的多種細胞周期蛋白呈正相關,同時Western blot及RT-qPCR 結果表明,下調KCTD11 會導致Myc、CDK2、CDK4、CDK6、CCND3 及CCNE2等多個基因的mRNA 及蛋白表達顯著下調。

Myc作為目前研究最為廣泛的原癌基因之一,參與腫瘤細胞的增殖、代謝重編程、遷移和侵襲等多種生理過程,與多種腫瘤的發生和發展密切相關[11-14]。作為轉錄因子,其能夠直接轉錄激活多種細胞周期蛋白的表達,如CDK2、CDK4、CDK6 及CCND3 等[15-17]。本研究發現,敲低KCTD11,會抑制Myc及多個細胞周期蛋白的表達,且數據庫數據表明KCTD11的表達與Myc表達呈正相關。因此,推測KCTD11可能通過調控Myc的表達,進而調控細胞周期蛋白的表達。為驗證這一假設,本研究在HeLa細胞中過表達融合Flag標簽的KCTD11蛋白,并利用Flag標簽抗體進行ChIP分析。結果表明KCTD11 能夠結合到Myc的啟動子上,從而激活Myc的表達。

綜上所述,本研究表明KCTD11能夠通過轉錄激活Myc的表達,上調細胞周期蛋白的表達,從而促進宮頸癌的進展,抑制KCTD11的表達可作為宮頸癌治療的潛在靶點。