血清miR-296-5p及胃蛋白酶原mRNA 表達水平對胃癌診斷和預后評估的臨床價值

白菊芳,許國彩,劉芝蘭,薛曉紅

青海省人民醫院消化內科,青海西寧 810000

胃癌是全球第五大常見惡性腫瘤,也是全球癌癥相關死亡的第三大原因。2018年,全球新發生胃癌約100萬人,78.3萬人死亡[1-2]。早期胃癌僅限于黏膜和黏膜下層,其癥狀與良性消化性潰瘍無法鑒別。對這部分胃癌患者進行篩查可提高早期胃癌的檢出率,從而提高其預后。微小RNA(miRNAs)是高度保守的、小的(長度為19～25個核苷酸)單鏈 RNA,其顯著特征是不編碼蛋白質[3]。研究表明,miRNAs 在多種腫瘤組織基因組中異常表達并在血液中保持穩定。此外,miRNAs參與各種生物學過程,如增殖、分化和轉移。miRNAs 參與胃癌的發生和進展,這表明miRNAs可以作為診斷治療胃癌的標志物[4-5]。miR-296-5p是一種多功能miRNA,在不同的癌癥中具有不同的功能。miR-296-5p的致腫瘤作用已在前列腺癌、肺癌、肝細胞癌、鼻咽癌和結直腸癌中得到證實[6-7]。胃蛋白酶原屬于天冬氨酸蛋白酶家族,在病理條件下,胃蛋白酶原表達水平發生顯著變化;在淺表性胃炎、萎縮性胃炎、胃癌的動態變化過程中,胃黏膜中胃蛋白酶原的原位表達明顯升高,說明胃蛋白酶原是比較理想的診斷胃癌的標志物[8]。本研究擬探討血清miR-296-5p及胃蛋白酶原mRNA 在胃癌診斷和預后評估中的臨床價值,為胃癌的診斷治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年3月至2019年3月在本院經病理證實的胃癌患者198例為胃癌組,其中男102例,女96例;年齡47～74歲,平均(58.73±5.56歲)。選擇198例胃部良性疾病患者為胃病組,其中胃潰瘍95例,胃炎103例;男106例,女92例;年齡48～72歲,平均(58.21±5.73歲);選擇同期198例健康體檢者作為對照組,其中男105例,女93例;年齡49～75歲,平均(58.85±5.68)歲。所有患者術前均未接受過相關治療。手術治療切除癌組織后,標本固定在甲醇中進行病理分析。本研究已獲得本院醫學倫理機構審查委員會的批準,所有患者均簽署知情同意書。根據美國癌癥聯合委員會(AJCC)分期對腫瘤進行分類。

1.2 方法

1.2.1 血清中miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表達水平檢測 采集所有研究對象靜脈血標本5 mL,在4 ℃下以3 000×g離心15 min,將上清液轉移到1.5 mL無RNase管中,并在-80 ℃下儲存待用。

使用TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,批號:CV-5986.69)從血清中提取總RNA,并用 DNase I(Promega,Madison,WI,批號:BC-74856.69)消化基因組DNA。使用 ImProm-ⅡTM逆轉錄系統(Promega,DC-56963.63)逆轉錄11 g RNA 為cDNA,逆轉錄條件為42 ℃ 60 min,85 ℃ 10 min。使用SYBR GREEN qPCR Super Mix(Invitrogen)和Applied Biosystems 7500系統(Applied Biosystems,Foster City,CA)進行RT-PCR,條件如下:95 ℃變性10 min,95 ℃ 15 s,65 ℃ 32 s,40個循環。miR-296-5p、胃蛋白酶原、GAPDH 引物由武漢金開瑞生物科技公司合成。引物序列如下:miR-296-5p 正向,5'-TCA CGT AGC TAG CTA GCT AGC TGA TCG ATC GAT GCT AG-3';反向5'-TGC GAT CGA TCG TAG CTA GTC GAT GCT AGC TAG CTA GTG-3'。胃蛋白酶原正向,5'-TGT GTA GTC GAT CGT AGC TAG CTG ATC GAT GCT AGC TAG CTC G-3';反向5'-TGT GTC GTA GCT AGT CGA TGC TAG GAT GCT AGT CGA TCG ATG CT-3,;GAPDH 正向,5'-TGT GCT GAT GCT AGC TAG TCG ATC GAT GCT AGC TAG TCG ATG CAG T-3';反向5'-TGT GCA TGC TAG CTA GTC GAT GCT AGT GTG ATG CGA GTC GAT GTC-3'。使用改良2-ΔΔCt方法計算miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA的相對表達水平,并以GAPDH 作為內參進行歸一化。

1.2.2 隨訪 隨訪方式為電話隨訪,內容主要為術后生活質量,隨訪開始日期為出院日期,結束日期為2021年5月1日。

1.3 統計學處理 采用SPSS23.0對數據進行統計學分析。正態分布的計量資料采用表示,多組間比較采用方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;非正態分布的計量資料采用M(P25,P75)表示,組間比較采用秩和檢驗。計數資料采用百分數表示,組間比較采用χ2檢驗;采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表達水平對胃癌的診斷價值;以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表達水平比較 胃癌組和胃病組miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表達水平高于對照組(P<0.05);胃癌組miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表達水平高于胃病組(P<0.05)。見表1。

表1 3組miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表達水平比較()

表1 3組miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表達水平比較()

注:與對照組比較,aP<0.05;與胃病組比較,bP<0.05。

2.2 miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表達水平與臨床病理特征的關系 以胃癌組miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 均值4.14、6.99為界值,≤4.14、≤6.99分別為miR-296-5p低表達組、胃蛋白酶原mRNA 水平低表達組;>4.14、>6.99分別為miR-296-5p高表達組、胃蛋白酶原mRNA 水平高表達組。

結果顯示,miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表達水平與性別、年齡無關(P>0.05);與腫瘤最大徑、TNM 分期、浸潤深度、淋巴結轉移和復發有關,且腫瘤最大徑≥5 cm、TNM 分期越高、浸潤深度越深、有淋巴結轉移、有復發的胃癌患者其miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 高表達率越高(P<0.05)。見表2。

表2 miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表達水平與胃癌臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 不同miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表達水平的胃癌患者預后比較 所有胃癌患者自出院后至隨訪結束存活時間4～60 個月,5 年生存率為45.4%(90/198)。miR-296-5p 高表達組、胃蛋白酶原mRNA 高表達組5 年生存率及生存期明顯低于miR-296-5p和胃蛋白酶原mRNA 低表達組(P<0.05)。見表3。

表3 不同miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表達水平的胃癌患者預后比較

2.4 miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 診斷胃癌的臨床價值 miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 聯合檢測診斷胃癌的曲線下面積(AUC)、靈敏度、特異度、準確度均高于miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 單獨檢測(P<0.05);見表4。

表4 miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 診斷胃癌的臨床價值分析

續表2 miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表達水平與胃癌臨床病理特征的關系[n(%)]

3 討論

癌癥在分子水平上表現出顯著的復雜性,與多個基因、蛋白質、通路和調節相互關聯。近年來,多項研究表明miRNAs可能是包括胃癌在內的多種癌癥診斷和預后的生物標志物[4-5]。據報道,miR-1236-3p的表達在胃癌組織中明顯降低,這表明該miRNA 可以作為胃癌的診斷和預后生物標志物;胃癌患者血清miR-25水平明顯上調,因此,miR-25可用作胃癌診斷和預后的標志物[6]。miR-296-5p是miR-296家族成員,在惡性腫瘤中高表達并作為經典的癌基因參與癌變[7-8]。既往研究報告了循環miR-296-5p 在惡性腫瘤中的表達水平上調,如非小細胞肺癌(NSCLC),以及宮頸癌、肝癌、結直腸癌和前列腺癌[9]。DONG等[10]通過篩選惡性腫瘤患者的循環miRNA 表達譜鑒定了5種血清miRNA(miR-1、miR-20a、miR-27a、miR-34和miR-296-5p)在肝癌診斷中具有潛力。同時,有研究者報道,血清miRNA 診斷乳腺癌的AUC明顯高于經典生物標志物,如癌胚抗原(0.503)和糖類抗原19-9(0.600)[11]。研究報道,miR-296-5p可能通過靶向調節核因子(NF)-κB 抑制劑來促進NF-κB信號通路和下游靶標livin和survivin的激活進而參與肝癌的進展[12]。miR-296-5p在多種癌癥中起著至關重要的作用[13];miR-296-5p 促進了膠質母細胞瘤細胞的侵襲,并表明miR-296-5p可能是膠質母細胞瘤的治療靶標;與正常腸黏膜相比,miR-296-5p表達水平在結直腸癌組織中明顯升高[14]。已有研究證明,miR-296-5p在結直腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織,miR-296-5p是影響結直腸癌患者5年生存期的獨立預后因素[15]。

本研究結果顯示,胃癌組miR-296-5p 表達水平高于胃病組與對照組(P<0.05);miR-296-5p與胃癌患者腫瘤最大徑、TNM 分期、浸潤深度、淋巴結轉移和復發有關,且腫瘤最大徑≥5 cm、TNM 分期越高、浸潤深度越深、有淋巴結轉移、有復發,miR-296-5p高表達率越高(P<0.05)。miR-296-5p高表達組胃癌患者5年生存率及生存期明顯低于miR-296-5p低表達組(P<0.05)。這說明胃癌患者血清miR-296-5p表達水平升高,miR-296-5p 與胃癌患者臨床病理特征、預后有關。

胃蛋白酶原是胃細胞成熟的標志物,其變化可反映胃部病變程度。研究發現,胃蛋白酶原抗原在不同胃病中表達水平不同,胃蛋白酶原在正常胃黏膜中的高表達率為15.0%,在胃癌中為65.9%;在不同疾病中,胃蛋白酶原高表達率從低到高依次為良性病變、癌前病變和胃癌[16]。臨床流行病學研究發現,血清胃蛋白酶原異常的成年居民具有更高的胃黏膜癌前病變(腸上皮化生和上皮異常增生)發生風險[17]。本研究發現,胃癌患者血清胃蛋白酶原mRNA 表達水平升高,胃蛋白酶原mRNA 表達水平與胃癌患者臨床病理特征、預后有關,這與上述研究結論一致。

血清胃蛋白酶原可以反映胃黏膜的組織學狀況,對胃癌具有潛在的診斷價值。有研究顯示,miR-92a與胃蛋白酶原聯合檢測對胃癌診斷的靈敏度和特異度分別為86.49%和89.32%[18]。本研究中,miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 聯合檢測診斷胃癌的靈敏度、特異度、準確度、AUC均高于miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 單獨檢測(P<0.05)。這說明,miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 聯合檢測篩查胃癌具有較高的靈敏度、特異度,可在臨床上應用。

綜上所述,胃癌患者血清miR-296-5p 及胃蛋白酶原mRNA 表達水平升高,miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表達水平與胃癌患者臨床病理特征、預后有關;miR-296-5p、胃蛋白酶原聯合檢檢測診斷胃癌具有較高的靈敏度、特異度,可在臨床上推廣應用。