PLAC8在子宮內膜癌中的表達及其調控癌細胞增殖和凋亡的機制*

代永娟,高 燕,楊 建

成都醫學院第三附屬醫院/成都市郫都區人民醫院腫瘤血液科,四川成都 611730

胎盤特異性蛋白8(PLAC8)也稱為onzin,在骨髓細胞、淋巴細胞和肺、腸的上皮細胞等各種類型細胞中表達[1]。PLAC8 在正常組織穩態中發揮重要作用,研究顯示其表達異常導致多種疾病和人類腫瘤的發生、發展,PLAC8在肺癌、乳腺癌和結直腸癌等常見惡性腫瘤中均發揮促癌作用,促進腫瘤細胞生長、侵襲和轉移,抑制腫瘤細胞凋亡[2-4]。然而,PLAC8在子宮內膜癌進展中的確切功能和潛在機制仍不清楚。HUANG 等[5]報道PLAC8 與蛋白 激酶B(AKT)相互作用,激活AKT/mTOR 信號通路促進鼻咽癌惡性進展。AKT/mTOR 信號通路在細胞生長、凋亡以及化療耐藥等生物過程中均具有重要作用,可作為藥物干預的靶點[6]。且AKT/mTOR 信號通路在子宮內膜癌中也處于激活狀態[7],而PLAC8是否可以調控AKT/mTOR 信號通路促進子宮內膜癌細胞增殖,抑制細胞凋亡尚不清楚。本研究旨在探討PLAC8在子宮內膜癌惡性進展中發揮的重要作用,探討PLAC8是否可以作為子宮內膜癌預后判斷的生物標志物和治療的潛在新分子靶點,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年3月至2016年9月保存于本院病理科的子宮內膜癌石蠟包埋組織塊80例,正常子宮內膜石蠟包埋組織塊36例。患者均沒有放療或化療史;組織標本的病理診斷由兩名專門病理醫師確認;臨床病理、隨訪預后資料完整(患者術后3個月隨訪一次,隨訪60個月或者患者死亡時終止)。80例子宮內膜癌患者中死亡52例,存活28例。所有研究對象均簽訂知情同意書。標本的使用得到了本院倫理委員會的批準。

1.2 試劑來源 細胞培養瓶及培養板購于美國Corning公司;子宮內膜癌細胞株Ishikawa購于中科院上海細胞庫;胎牛血清、DMEM-F12培養基購于美國Gibco公司;NC 短發夾RNA(shRNA)或PLAC8 shRNA 購于上海吉瑪基因技術有限公司;兔源PLAC8一抗、兔源Ki67一抗、兔源AKT 一抗、鼠源pAKT 一 抗、兔源mTOR 一抗、兔 源pmTOR 一 抗、HRP偶聯的羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗購于英國Abcam 公司;MTS試劑購于上海同仁化學技術有限公司;細胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學法(IHC) 4 μm 石蠟切片經脫蠟和水化后,在抗原修復液中微波1 min,浸入3%過氧化氫中10 min,阻斷內源性過氧化物酶活性。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次后,用3%牛血清蛋白封閉15 min。將切片與抗兔PLAC8抗體在4 ℃下孵育過夜、二抗室溫孵育1 h。PBS洗3次后,加入顯色液。蘇木精復染后,分級乙醇中脫水,封片。染色測定結果由兩名病理學專家獨立評估和評分。PLAC8染色強度評分標準如下:強,3分;中等,2分;弱,1分;陰性,0分。PLAC8染色面積評分標準如下:>75%,4分;>50%～75%,3 分;>25%～50%,2 分;>10%～25%,1分;≤10%,0分。最終染色分數:染色強度分數×染色面積分數。最終染色分數≥2 分定義為PLAC8高表達,<2分定義為PLAC8低表達。Ki67增殖指數按熱點區域進行評價,即陽性腫瘤細胞數/總的腫瘤細胞數×100%。

1.3.2 細胞培養、轉染和分組 子宮內膜癌細胞株Ishikawa采用含有10%胎牛血清的DMEM-F12 培養基培養,放置在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱內培養。Ishikawa細胞呈對數生長期時,胰酶消化收集細胞,將細胞按2×105個/孔接種于6孔板內,分為sh-NC組、sh-PLAC8-1組、sh-PLAC8-2組。按照Lip 2000轉染試劑說明書進行轉染,取5 μg NC shRNA或PLAC8 shRNA-1、PLAC8 shRNA-2分別與1 mL無血清DMEM-F12培養基混勻后室溫孵育5 min,5 μL Lip 2000與1 mL無血清DMEM-F12培養基混勻后室溫孵育5 min。NC shRNA 或 PLAC8 shRNA-1、PLAC8 shRNA-2分別加入各組Ishikawa細胞中。轉染48 h后,通過Western-blot檢測沉默效率。

1.3.3 MTT 試驗檢測細胞增殖能力 細胞轉染48 h后收集sh-NC 組和sh-PLAC8-1組、sh-PLAC8-2組細胞,將細胞調整至濃度為1×104個/毫升的單細胞懸液。向96孔板中加入100 μL 細胞懸液,每組設置1、2、3、4及5 d檢測時間點,每個時間點設置6個復孔,放置在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱內培養。于對應的檢測點每孔加入20 μL MTS試劑,繼續孵育2 h后采用全波長掃描儀檢測各樣品在490 nm 波長處的吸光度值(A 值)。

1.3.4 細胞凋亡檢測 取處于對數生長期的細胞采用無EDTA的胰酶消化收集sh-NC 組和sh-PLAC8-1組、sh-PLAC8-2組細胞,PBS洗3洗后,細胞沉淀采用250 μL 緩沖液重懸,并用尼龍網過濾。并加入5 μL FITC和10 μL PI染色液混勻后,于常溫下避光孵育10 min。通過流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況。

1.3.5 Western-blot 胰酶消化sh-NC 組和sh-PLAC8-1組、sh-PLAC8-2組細胞,加入RIPA 裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑混合物混勻,冰上裂解30 min,裂解液在4 ℃以12 000×g離心15 min,獲得蛋白裂解液。根據說明書,使用BCA 蛋白質檢測試劑盒測定蛋白質濃度,蛋白煮沸變性。等質量的蛋白質樣品通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳-SDS(PAGE-SDS)分離,并濕轉將蛋白轉移到硝酸纖維素濾膜(PVDF膜)上。PVDF膜在室溫下與5%脫脂奶粉孵育封閉1 h。TBST 洗3 次后,膜與AKT、pAKT、mTOR 和pm-TOR 和GAPDH 一抗稀釋液4 ℃孵育過夜。TBST洗3次后,PVDF膜與HRP偶聯的羊抗兔、羊抗鼠二抗室溫孵育2 h。使用 ChemiDocTMMP 成像系統可視化蛋白條帶成像。

1.4 統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件進行分析。所有試驗重復3次。使用Graph Pad Prism 軟件作圖展示。計數資料采用百分數表示,組間比較采用χ2檢驗。計量資料采用表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。通過Kaplan Meier法繪制患者生存曲線,采用Log-Rank 法進行檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PLAC8在子宮內膜癌組織中高表達 IHC 結果顯示,80例子宮內膜癌和36例正常子宮內膜中的PLAC8陽性表達率分別為58.75%和41.25%,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1。

圖1 PLAC8在子宮內膜癌組織和正常子宮內膜組織中的表達(×100)

2.2 PLAC8表達與子宮內膜癌患者病理參數的關系 腫瘤級別高、國際婦產科協會(FIGO)分期為Ⅲ～Ⅳ期、Ki67 增殖指數>50的子宮內膜癌中PLAC8陽性表達率明顯增高(P<0.05)。發病年齡、是否絕經、腫瘤組織類型、肌層浸潤深度和淋巴結是否轉移等因素與PLAC8表達無關(P>0.05),見表1。

表1 子宮內膜癌患者組織中PLAC8表達情況與臨床病理參數的關系[n(%)]

續表1 子宮內膜癌患者組織中PLAC8表達情況與臨床病理參數的關系[n(%)]

2.3 PLAC8表達與子宮內膜癌患者生存時間的關系 PLAC8高表達患者中死亡34例,5年生存率為27.66%;PLAC8低表達患者中死亡18例,5年生存率為45.45%。繪制患者生存曲線,經分析,高表達PLAC8的子宮內膜癌患者其生存時間短于低表達PLAC8者(χ2=5.082,P=0.024)。

2.4 PLAC8 shRNA 轉染子宮內膜癌細胞的結果在sh-NC 組和sh-PLAC8-1 組、sh-PLAC8-2 組子宮內膜癌細胞中PLAC8蛋白表達水平分別為1.13±0.14和0.30±0.07、0.39±0.04。sh-PLAC8-1組和sh-PLAC8-2組中的PLAC8蛋白表達水平明顯低于sh-NC組(P<0.001),見圖2。

圖2 PLAC8 shRNA 轉染成功的Ishikawa子宮內膜癌細胞

2.5 細胞增殖能力檢測 第5天時,sh-PLAC8-1和sh-PLAC8-2組中的細胞增殖數量明顯低于sh-NC組中的細胞增殖數量,差異有統計學意義(P<0.05),見圖3。

圖3 PLAC8 shRNA 轉染Ishikawa子宮內膜癌細胞的生長曲線

2.6 細胞凋亡情況 sh-NC 組和sh-PLAC8-1、sh-PLAC8-2組子宮內膜癌細胞凋亡率分別為4.65%±1.62%和21.93%±5.98%、19.48%±3.57%。與sh-NC組相比,sh-PLAC8-1和sh-PLAC8-2組子宮內膜癌細胞凋亡率顯著增加(F=15.558,P=0.004),見圖4。

圖4 流式細胞術分析PLAC8 shRNA 轉染子宮內膜癌細胞的細胞凋亡情況(×100)

2.7 AKT/mTOR 信號通路檢測 sh-NC 組、sh-PLAC8-1和sh-PLAC8-2 組細胞中AKT 和mTOR蛋白表達無明顯變化。與sh-NC 組比較,sh-PLAC8-1和sh-PLAC8-2組細胞中pAKT 和pmTOR 蛋白表達明顯降低(P<0.05),見圖5。

圖5 PLAC8 shRNA 轉染癌細胞中AKT、pAKT、mTOR 和pmTOR的表達水 平

3 討論

PLAC8是一種相對分子質量為12.5×103的蛋白質,其分子結構從兩棲動物到人類都高度保守,PLAC8被證明參與調節代謝和免疫等各種細胞生理過程,以及細胞增殖、分化、凋亡、侵襲、轉移、耐藥性生成等腫瘤病理過程,其作用機制可能是通過調控PI3k/AKT/NF-κB、PI3K/AKT/GSK3β、TGF-β/SMAD等信號途徑發揮作用[8-10]。子宮內膜癌的發病率和病死率逐年增加,嚴重威脅女性患者生命健康[11]。大多數子宮內膜癌患者可選擇的治療手段療效有限,預后較差[12]。研究顯示,任何組織學的ⅢB期或ⅢC 期疾病以及ⅠA 期(伴有肌層浸潤)、ⅠB、Ⅱ或ⅢA 期漿液性或透明細胞癌是子宮內膜癌患者預后不良的因素[13],但是子宮內膜癌的發病機制尚未完全闡明,因此,了解子宮內膜癌的發病機制對于探索子宮內膜癌的預防和治療策略至關重要。PLAC8在子宮內膜癌中發揮的作用未知,研究PLAC8在子宮內膜癌中發揮的作用及作用機制,對于探索子宮內膜癌治療的分子靶點具有重要意義。

本研究采用IHC 檢測發現PLAC8 蛋白在子宮內膜癌組織中表達上調,說明PLAC8在子宮內膜癌中的表達異常,提示PLAC8在子宮內膜癌的發病過程中可能發揮重要作用,考慮為候選癌基因。同時本研究發現,PLAC8 高表達與患者腫瘤級別高、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期和Ki67增殖指數>50相關,且PLAC8高表達的子宮內膜癌患者預后較差,說明PLAC8與子宮內膜癌惡性進展密切相關,是子宮內膜癌預后不良的分子標志物,提示PLAC8在子宮內膜癌中發揮重要的生物學功能,相關研究也顯示,肺癌和乳腺癌組織中PLAC8表達升高,并且PLAC8高表達與肺癌患者腫瘤大小、組織學分級和淋巴結轉移及TNM 分期呈正相關,高表達PLAC8的肺癌患者預后較差[2-3]。研究顯示,PLAC8過表達在體外和體內促進乳腺癌細胞增殖和遷移并抑制細胞凋亡[3],敲低PLAC8的表達導致胰腺神經內分泌腫瘤細胞的增殖和活力降低[14]。本研究采用shRNA 干擾PLAC8的表達,采用MTS和細胞凋亡試驗檢測PLAC8是否在細胞水平影響子宮內膜癌的增殖和凋亡能力,結果顯示敲低PLAC8的表達在體外顯著抑制子宮內膜癌細胞的增殖,促進腫瘤細胞凋亡的發生,表明PLAC8在子宮內膜癌中發揮促癌基因作用,提示PLAC8是子宮內膜癌進展中的重要分子。

PLAC8在子宮內膜癌中的作用機制仍需進一步探討,細胞凋亡是程序性細胞死亡的主要機制,機體通過不同的機制維持正常生理和細胞穩態。在腫瘤細胞中,細胞凋亡受到抑制,細胞惡性增殖失控,從而導致腫瘤的惡性進展[15]。PLAC8可通過調控不同的信號通路促進不同的腫瘤惡性表型,既往研究顯示,PLAC8通過調控PI3k/AKT/NF-κB信號通路抑制乳腺癌細胞凋亡[3]。PLAC8通過抑制 PI3K/AKT/GSK3β信號通路促進鼻咽癌的放射抗性[9]。HUANG 等[10]報道,敲低PLAC8的表達后,TGF-β/SMAD 信號通路失活并抑制鼻咽癌細胞增殖、傷口愈合、遷移、侵襲及異種移植物的生長。研究顯示,在鼻咽癌細胞中PLAC8 與AKT 共定位,兩者可以相互作用,干擾PLAC8的表達,其可通過抑制AKT/mTOR 信號通路抑制細胞增殖,并促進鼻咽癌細胞的凋亡[5]。AKT/mTOR 信號通路在腫瘤的發生發展中發揮重要作用[6],提示PLAC8在子宮內膜癌中發揮作用可能是通過調控AKT/mTOR 信號通路實現的,本研究Western-blot檢測結果顯示干擾PLAC8顯著抑制子宮內膜癌細胞中pAKT 和pmTOR 蛋白的表達。表明干擾PLAC8的表達顯著抑制子宮內膜癌細胞AKT/mTOR 信號通路,提示PLAC8可能通過激活AKT/mTOR 信號通路在子宮內膜癌中發揮作用,但PLAC8是否通過直接與AKT 相互作用激活AKT/mTOR 信號通路進而促進子宮內膜癌的惡性進展本文未進行深入研究,這也是本課題組后續的研究方向。

綜上所述,子宮內膜癌中PLAC8呈高表達,敲低PLAC8表達能促進癌細胞的凋亡,其機制可能是通過調控AKT/mTOR 信號通路起作用。