染色體微陣列技術在產科和兒科遺傳病診斷中的臨床應用價值分析*

田海英 ,羅真真 ,汪琳琳 ,張 紅 ,劉慶華△

山東第一醫科大學第二附屬醫院:1.檢驗科;2.血液科,山東泰安 271000

染色體作為人類的遺傳物質,是導致人類出生缺陷的重要原因之一,且目前尚無有效的治療方法,只能依靠產前診斷達到預防染色體疾病的目的[1]。染色體微陣列技術(CMA)可實現全基因組水平檢測染色體不平衡的拷貝數變異(CNV),尤其是對于染色體微缺失、微重復有更高的檢出率,是染色體核型分析的有效補充[2]。已經有大量的研究證實,CNV 與許多疾病相關,包括數百種染色體的微缺失、微重復綜合征,并且是先天性發育障礙的主要病因,包括自閉癥[3]、智力障礙[4]、行為異常、肌張力減退等,嚴重影響患者的生活質量,給患者家庭帶來沉重的精神和經濟負擔。CMA 在產前診斷領域應用的臨床指征主要有高齡、無創DNA 檢測(NIPT)高風險、夫妻一方染色體異常、B 超異常、不良孕育史等[5]。本研究分析CMA 在異常臨床表現患者中的檢測情況,為臨床醫生提供參考依據,從而降低出生缺陷,提高人口素質。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年2月至2020年12月在泰安地區部分醫院產科、生殖醫學中心、優生優育門診就診的287例孕婦為研究對象,年齡18～45歲,中位年齡31歲。孕婦均已簽署知情同意書。因單純高齡(≥35歲)、高齡合并NIPT 高風險、高齡合并超聲異常以及高齡合并不良孕育史而進行羊水穿刺產前診斷的孕婦63例;因NIPT 高風險而進行羊水穿刺產前診斷的孕婦110例;因超聲發現胎兒結構異常而進行產前診斷的孕婦47例;因不良孕育史而進行產前診斷的孕婦22例;因夫妻一方染色體異常而進行羊水穿刺產前診斷的孕婦18例;孕期服藥、促排卵助孕、接觸射線等其他原因進行羊水穿刺產前診斷的孕婦18例;因胚胎停育、B超確診異常等原因導致流產進行流產組織CMA 檢測的孕婦17例。同時選擇兒科、康復科及新生兒科就診的早產兒、高危兒、先天畸形及不明原因發育遲緩患兒共118 例為研究對象。患兒年齡4 h至15歲,所有患兒均抽取外周血進行CMA 檢測,由其父母或監護人簽署知情同意書。并進一步收集25例檢測到致病位點的患兒父母外周血標本,進行CMA 檢測,判斷患兒的染色體異常片段是否來源于父母。

1.2 方法 排除介入性穿刺禁忌證后,在超聲引導下進行羊膜腔穿刺術抽取30 mL左右的羊水,取適量用于CMA 檢測。采集118例患兒的外周血2 mL,枸櫞酸鈉抗凝,應用QIAGEN 試劑盒提取基因組DNA。應用美國Affymetrix公司生產的CytoScan-HD(195萬CNV 探針+75萬SNP探針)芯片對樣本進行檢測。取流產組織絨毛或流產組織,檢測前,流產物DNA 均經過與母血DNA的連鎖分析排除母體細胞污染。

3種標本均采用Affymetrix公司配套檢測試劑盒及優化的標準操作流程,使用CytoScanHD/Cyto-Scan750K 進行全基因組范圍掃描。具體流程如下:(1)嚴格按照質控標準進行DNA 提取、酶切、連接、PCR、PCR 產物純化、片段化、標記,再以染色體DNA探針實施全面覆蓋,使之與支持物固定在一起后與標記分子進行雜交;(2)對DNA 雜交信號進行監測,通過相應的信息技術、CHAS軟件對收集樣本分子的數量以及序列信息進行檢測;(3)得到的數據應用軟件Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software進行分析結果,最終通過查閱DECIPHER、ISCA、OMIM、NCBI PubMed等數據庫進行結果判讀,評估染色體是否存在非整倍體異常、整倍體異常、微缺失、雜合性缺失異常等。

1.3 統計學處理 采用SPSS20.0對數據進行整理。計數資料采用百分數表示。

2 結果

2.1 CMA 檢出的染色體異常類型分析 287例不同產前診斷指征的標本包括270例羊水穿刺標本和17例流產組織標本,CMA 共檢出73 例明確致病的病例,包括64例羊水穿刺標本和9例流產組織標本;其中常染色體數目異常病例18例,常染色體致病性片段異常病例14例;性染色體數目異常病例29例,性染色體致病性片段異常病例11例;三倍體1例。在致病性片段異常病例中,小片段異常(1～10 Mb)病例12例,微小片段(<1 Mb)2 例,占比為19.2%(14/73),見表1。25例染色體異常但意義不明確的病例(VOUS),所占比例為8.71%(25/287),包括20例羊水穿刺標本和5例流產組織標本。

表1 CMA 檢出的染色體異常類型分析(n=73)

2.2 CMA 在不同產前診斷指征中檢出確診病例的分析 根據羊水穿刺指征可以分為高齡、NIPT 高風險、夫妻一方染色體異常、B 超異常、不良孕育史、血清學篩查風險、高齡合并NIPT 高風險、高齡合并不良孕史和其他(包括孕期用藥、接觸射線等)等。經統計發現,CMA 檢出確診病例最多的產前指征為NIPT高風險,共檢出異常病例45例,檢出率為40.91%;其次為高齡合并NIPT 高風險,共檢出確診病例10例,檢出率為76.92%。見表2。

表2 CMA 在不同產前診斷指征中檢出確診病例的分析

2.3 CMA 對不同類型CNV 患兒檢測能力 對118例患兒進行CMA 檢測,明確致病的病例有58例,檢出率為49.15%;VOUS 共8 例,檢出率為6.78%。所有陽性標本檢測的CNV 類型分為染色體缺失(≥50 Kb)、染色體重復(≥10 Kb)、單親二倍體(包括印跡染色體:染色體末端純合片段>5 Mb或染色體中間純合片段>15 Mb;非印跡染色體:染色體末端純合片段>10 Mb或染色體中間純合片段>20 Mb)、染色體缺失合并重復、非整倍體和嵌合體6類,見表3。在檢測出染色體的片段中重復(≥10 Kb)的病例為18例,異常片段(1～10 Mb)的病例有30例,小片段(≤1 Mb)的病例有10例,檢出率為17.2%。

表3 CMA 檢測58例明確致病病例CNV 類型

2.4 118例患兒的臨床表型及CMA 檢測情況 按照臨床表型分類進行陽性率的分析,結果顯示,多表型患兒陽性率要高于單一表型患兒的陽性率,見表4。

表4 118例患兒的臨床表型及CMA 檢測結果

2.5 CMA 對25例染色體異常標本的遺傳方式的檢測情況 有25例檢測到致病位點的患兒父母,通過采集患兒父母外周血標本進行CMA 檢測,其中8例與患兒在相同區域發現染色體異常,為其再次生育提供了遺傳風險咨詢,以避免再次生育類似的患兒。有2例因CMA 不能檢測平衡易位,故建議應用FISH或高分辨率染色體核型分析來確認患兒是否遺傳自父母。見表5。

表5 25例染色體異常標本的遺傳方式分類

3 討論

在產前診斷和產后遺傳病的檢測中,CMA 具有分辨率較高的優勢,而且相比于傳統的染色體核型分析技術,優化了檢測流程,不需要費時費力培養細胞,檢測出微小片段的缺失和重復的概率較高[6]。然而,CMA 因無法檢測出平衡性染色體重排,如易位等、倒位等具有一定限制[7],從而無法完全替代傳統的染色體核型分析[8]。染色體異常不僅有數目的異常還有結構的異常,CMA 可檢測出1～10 Mb的小片段以及小于1 Mb的微小片段CNV[9],是核型分析的有效補充,既可以提高染色體異常的檢出率,避免缺陷兒的出生,又可以對再次生育進行遺傳風險評估。

本研究結果顯示,CMA 在羊水穿刺標本、流產組織標本以及外周血標本中,片段≤10 Mb的檢出率較高,更能檢測出微小片段的缺失和重復。本研究納入的NIPT高風險標本數量占比最高,達到38.3%(110/287),且CMA檢測出的確診病例達到40.91%,尤其是高齡合并NIPT 高風險的檢出率達到76.92%;其他臨床指征中B超異常的確診病例檢出率為19.15%,對于發現異常胎兒或于孕期發現并明確診斷NIPT高風險病例具有重要的臨床意義[10]。CNV 在其他研究中又被分為致病性CNV、可能致病性CNV 和VOUS[11]。VOUS是指不能明確該異常CNV的致病性[12],本研究中羊水標本VOUS總占比為8.71%,患兒外周血標本VOUS總占比為6.78%。國內相關的臨床數據不足,需要更多的積累完善數據信息庫調整報告閾值標準等方式來降低VOUS的比例[13]。隨著芯片技術的不斷發展,相信會有更多CNV的臨床意義被明確。

自然流產大多是由于染色體異常所致[14],傳統的檢測手段如核型分析只能檢測≥5 Mb的染色體異常,熒光原位雜交雖然不需要培養,但僅對特定的目標染色體的數目異常進行檢測,全部的染色體難以實現精準定位。本研究共收集了17例流產組織標本,成功檢測出明確致病標本9例,檢出率達52.9%,其中染色體數目異常的有7例,包括1例22-三體、1例18-三體、1例16-三體等以及1例三倍體(69,XXY)。通過對流產組織標本進行相關檢測,有利于尋找流產的原因,進而指導下一次的妊娠[15]。

CMA 檢測適應證較為廣泛,發育遲緩、智力低下,先天性畸形以及兒童孤獨癥等均適用于CMA 檢測[16]。隨著CNV的不斷發展,越來越多的疾病,如癲癇、新生兒腦病、先天性心臟病等也被推薦為CMA檢測的適應證[17-18]。

CMA 發展較快,它為研究基因復雜性提供了強有力的手段,結合傳統的染色體分析技術,在臨床診斷中的作用不斷增強,值得推廣應用。