LncRNA HOTAIR 對宮頸癌Hela細胞增殖、凋亡和EMT的影響和作用機制*

陳文婷,黃麗珊,曾帶娣,陳志萍,吳志喜

南方醫科大學附屬東莞醫院/東莞市人民醫院婦產科,廣東東莞 523000

宮頸癌是較常見的婦科癌癥之一。據統計,全球每年有30多萬人死亡,其中85%以上發生在發展中國家,盡管近年來宮頸癌的手術、化療、放療等治療取得了很大的進展,但宮頸癌的臨床療效仍然較差[1]。因此,尋找新的生物標志物和治療靶點對提高宮頸癌的診斷和治療至關重要。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種轉錄本超過200個核苷酸,沒有蛋白編碼功能的特殊RNA 分子,LncRNA 與多種疾病及腫瘤的發生發展密切相關[2]。有報道稱,LncRNA 能夠廣泛參與生物體的各種生理及病理過程,如表觀遺傳學調控,以及神經系統功能的構建等[3]。有研究證實,LncRNA MEG3 具有抗宮頸癌的作用[4];LncRNA PANDAR 表達上調預示宮頸癌預后不良并促進細胞增殖[5]。LncRNA HOTAIR 是一種保守的LncRNA,其在不同的癌癥中發揮了重要的生物學功能。有學者發現,LncRNA HOTAIR 可增強雄激素受體介導的轉錄程序,驅動去勢抗性前列腺癌[6]。LncRNA HOTAIR 增強雌激素受體信號,并在乳腺癌中導致他莫昔芬耐藥[7]。然而,LncRNA HOTAIR在宮頸癌細胞中的表達和生物學功能尚不清楚。本研究通過分析LncRNA HOTAIR 在宮頸癌細胞中的表達模式,研究其生物學功能,探討宮頸癌的發病機制,為該病的治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌細胞(Hela細胞)和人永生化宮頸上皮細胞(H8 細胞)購自上海富衡生物科技有限公司。宮頸癌組織和癌旁正常組織(各53例)均來自本院2020年2—12月確診的患者,經過患者、家屬同意及倫理委員會批準后,進行采集和保存。DMEM 培養基購自北京索萊寶科技有限公司。PrimeScriptTMⅣ1st Strand cDNA Synthesis Mix、SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自武漢賽培生物科技有限公司。雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。HOTAIR 小干擾RNA(siRNA)、miR-20a-5p inhibitor、miR-20a-5p mimics、KIF26B siRNA 等質粒由Genepharma公司合成。Turbofect購自美國Invitrogen公司。點突變試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。Bax、Bcl-2 多克隆抗體購自美國圣克魯斯公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 Hela細胞和H8 細胞在添加含10%胎牛血清和1%抗菌藥物/抗真菌溶液中培養,放置于37 ℃,5% CO2濕潤培養箱中,待達到90%濃度后收集細胞,用于后續試驗。

1.2.2 細胞轉染 用指數期Hela細胞進行轉染。轉染前,將細胞接種于12孔板,采用2 mL 完全培養基培養24 h,直至90%的融合。用Turbofect試劑將質粒轉染到Hela細胞系中,并按說明用Opti-MEM無血清培養基培養,收集培養后細胞進行后續試驗。培養的Hela 細胞分為以下轉染組:(1)siRNA NC組、HOTAIR siRNA 組、KIF26B siRNA 組;(2)inhibitor NC 組、miR-20a-5p inhibitor組;(3)pcDNA-3.1(+)+mimics NC組、pcDNA-HOTAIR+mimics NC 組、pcDNA-3.1(+)+miR-20a-5p mimics 組、pcDNA-HOTAIR+miR-20a-5p mimics組;(4)HOTAIR wt+mimics NC 組、HOTAIR wt+miR-20a-5p mimics組、HOTAIR mut+mimics NC 組、HOTAIR mut+miR-20a-5p mimics 組;(5)KIF26B wt+mimics NC組、KIF26B wt+miR-20a-5p mimics組、KIF26B mut+mimics NC 組、KIF26B mut+miR-20a-5p mimics組;(6)siRNA NC+inhibitor NC組、HOTAIR siRNA+inhibitor NC組、siRNA NC+miR-20a-5p inhibitor 組、HOTAIR siRNA+miR-20a-5p inhibitor組。(1)組、(2)組、(6)組轉染組細胞用于實時定量PCR 檢測;(1)組、(2)組、(3)組轉染組細胞用于細胞活力、凋亡率和Western blot檢測;(4)組、(5)組轉染組細胞用于雙熒光素酶報告基因活性檢測。

1.2.3 細胞活力測定 將各組細胞按照一定的密度比例分別接種于96孔板,培養48 h后,每孔加入20 μL MTT 溶液,繼續培養4 h,棄上清液后,再向孔內加入DMSO 150 μL,震蕩10 min,發現結晶充分溶解后,用酶標儀測定波長 570 nm 處的吸光度(A)值,檢查細胞的存活率。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因試驗 利用軟件預測LncRNA HOTAIR 及miR-20a-5p的結合點,將HOTAIR 結合位點的野生序列(LncRNA HOTAIR wt)和突變序列(LncRNA HOTAIR mut)構建雙熒光素酶報告載體,并分別與miR-20a-5p mimics、mimics NC共轉染至Hela細胞;再將KIF26B結合位點的野生序列(KIF26B wt)和突變序列(KIF26B mut)分別與miR-20a-5p mimics、mimics NC共轉染至Hela細胞;48 h后,檢測細胞中熒光素酶活性。

1.2.5 實時定量PCR (RT-qPCR) 收集對數期的Hela細胞和組織,總RNA 從細胞和組織中提取(Trizol法),并檢查RNA 質量和水平(紫外分光光度法),按照制造商的說明,進行逆轉錄,轉化為cDNA,設置3 個復孔,重復3 次,內參為GAPDH,采用2-ΔΔCt法進行分析。試驗所用的引物見表1。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot 轉染后,用RIPA 裂解液裂解各組細胞,提取細胞蛋白,并測定所提取的蛋白水平。讓蛋白變性成蛋白凝膠后進行電泳試驗,再將蛋白轉印到PVDF 膜上,利用TBST(含5%脫脂奶粉)在4 ℃下孵育12 h,在PVDF 膜上加入一抗,孵育2 h,再在PVDF膜上加入二抗,孵育1 h。采用TBST 清洗PVDF膜3次,滴入ECL 反應液進行ECL 顯影,進行蛋白灰度值分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS20.0統計學軟件分析數據。計量資料以表示,各組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA HOTAIR siRNA 抑制Hela細胞與H8細胞的作用 RT-qPCR 結果顯示,Hela細胞中的LncRNA HOTAIR 表達量(1.89±0.07)相比H8細胞(0.83±0.08)明顯上調(P<0.01),宮頸癌組織中的LncRNA HOTAIR 表達量(2.37±0.42)相比癌旁正常組織(1.15±0.11)明顯上調(P<0.01)。LncRNA HOTAIR siRNA 轉染Hela細胞后HOTAIR表達量(0.35±0.06)顯著低于siRNA NC組(1.05±0.08),差異有統計學意義(P<0.01)。由圖1可知,LncRNA HOTAIR siRNA 轉染Hela細胞后顯著下調了細胞增殖能力(P<0.05)。HOTAIR siRNA 組細胞凋亡率(9.73%±0.71%)明顯高于siRNA NC組(4.25%±0.12%),差異有統計學意義(P<0.01);HOTAIR siRNA 組Bax和E-cadherin表達明顯上升(P<0.01),Bcl-2 和N-cadherin 表達量明顯下降(P<0.01)。見圖1。

圖1 LncRNA HOTAIR siRNA 對Hela細胞的作用

2.2 LncRNA HOTAIR 與miR-20a-5p的關系HOTAIR 和miR-20a-5p之間具有結合位點,當質粒攜帶LncRNA HOTAIR wt+miR-20a-5p mimics時,熒光素酶活性顯著低于LncRNA HOTAIR wt+mimics NC(P<0.01),當質粒攜帶LncRNA HOTAIR mut+miR-20a-5p mimics時,熒光素酶活性無變化(P>0.05)。見圖2。

圖2 LncRNA HOTAIR 與miR-20a-5p之間的靶向關系

2.3 miR-20a-5p inhibitor對Hela細胞的作用 分析RT-qPCR 結果可知,Hela 細胞中的miR-20a-5p表達量(0.35±0.09)相比H8細胞(1.06±0.10)明顯下調(P<0.01),宮頸癌組織中的miR-20a-5p表達量(0.47±0.04)相比癌旁正常組織(1.16±0.11)明顯下調(P<0.01)。miR-20a-5p inhibitor轉染Hela細胞后miR-20a-5p表達量(0.19±0.04)顯著低于inhibitor NC組(0.87±0.13),差異有統計學意義(P<0.01)。同時,miR-20a-5p inhibitor轉染Hela細胞后顯著上調了細胞增殖能力(P<0.05)。miR-20a-5p inhibitor組細胞凋亡率(2.86%±0.24%)明顯低于inhibitor NC 組(5.82%±0.49%)(P<0.01),miR-20a-5p inhibitor組Bax和E-cadherin表達量明顯下降(P<0.01),Bcl-2 和N-cadherin 表達量明顯上升(P<0.01)。見圖3。

圖3 miR-20a-5p inhibitor對Hela細胞的作用

2.4 LncRNA HOTAIR 通 過miR-20a-5p 對Hela細胞的調控作用 與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比,pcDNA-HOTAIR+mimics NC組Hela細胞增殖能力明顯升高(P<0.05),細胞凋亡率明顯降低(1.74%±0.11%),Bcl-2 和N-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01),Bax和E-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01),pcDNA-3.1(+)+miR-20a-5p mimics組Hela細胞增殖能力明顯降低(P<0.01),細胞凋亡率明顯上升(12.72%±1.46%),Bcl-2和Ncadherin蛋白表達量明顯降低(P<0.01),Bax和Ecadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01);與pcDNA-3.1(+)+miR-20a-5p mimics組相比,pcDNAHOTAIR+miR-20a-5p mimics組Hela細胞增殖能力明顯升高(P<0.01),細胞凋亡率明顯降低(5.27%±0.31%),Bcl-2 和N-cadherin 蛋白表達量明顯上升(P<0.01),Bax和E-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)。見圖4。

圖4 LncRNA HOTAIR 通過miR-20a-5p對Hela細胞的作用

2.5 miR-20a-5p與KIF26B 之間的關系 miR-20a-5p與KIF26B 之間具有結合位點,當質粒攜帶與KIF26B wt+miR-20a-5p mimics時,熒光素酶活性顯著低于與KIF26B wt+mimics NC 組(P<0.01),當質粒攜帶KIF26B mut+miR-20a-5p mimics時,熒光素酶活性無變化(P>0.05)。見圖5。

圖5 miR-20a-5p與KIF26B之間的關系

2.6 KIF26B 對Hela細胞的作用 分析RT-qPCR結果可知,Hela 細胞中的KIF26B 表達量(2.35±0.12)相比H8 細胞(1.08±0.11)明顯上調(P<0.01),宮頸癌組織中的KIF26B表達量(2.57±0.13)相比癌旁正常組織(1.15±0.08)明顯上調(P<0.01)。KIF26B siRNA 轉染Hela細胞后KIF26B表達量(0.49±0.06)顯著低于siRNA NC 組(0.94±0.05),差異有統計學意義(P<0.01)。KIF26B siRNA 轉染Hela細胞后顯著下調了細胞增殖能力(P<0.05)。KIF26B siRNA 組細胞凋亡率(7.26%±0.61%)明顯高于siRNA NC 組(4.12%±0.13%)(P<0.01),KIF26B siRNA 組Bax和E-cadherin表達明顯上升(P<0.01),Bcl-2 和N-cadherin表達量明顯下降(P<0.01)。見圖6。

圖6 KIF26B siRNA 對Hela細胞的作用

2.7 LncRNA HOTAIR 通過miR-20a-5p對KIF26B表達的影響 RT-qPCR 結果顯示,HOTAIR siRNA+inhibitor NC組KIF26B表達量明顯低于siRNA NC+inhibitor NC組,差異有統計學意義(P<0.01)。siRNA NC+miR-20a-5p inhibitor 組KIF26B表達量明顯高于siRNA NC+inhibitor NC組,差異有統計學意義(P<0.01)。HOTAIR siRNA+miR-20a-5p inhibitor組KIF26B 表達量明顯低于siRNA NC+miR-20a-5p inhibitor組,差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討論

LncRNA 可以在不同水平上調控基因表達,廣泛參與核導入、選擇性剪接和表觀遺傳學等多種生理過程。這些分子也可以作為結構成分,比如mRNA 衰變的調節因子,或者小RNA的前體。此外,越來越多的證據表明,LncRNA 表達異常可能是宮頸癌發生過程中的一個重要組成部分,例如LncRNA SNHG1可促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲[8]。另有研究表明,LncRNA RSU1P2作為內源競爭RNA(ceRNA)在宮頸癌細胞中對抗let-7a,參與腫瘤發生[9]。研究還發現,LncRNA MEG3具有抗宮頸癌作用[10]。LncRNA SNHG20通過miR-140-5p-ADAM10軸促進宮頸癌細胞增殖和侵襲[11]。HOTAIR 在2007年被識別[12]。已有研究表明,HOTAIR 參與了多種癌癥的發展。如LncRNA HOTAIR 通過下調SETD2促進人肝癌干細胞惡性生長[13]。另有研究表明,LncRNA HOTAIR 通過COX-2調控胃癌細胞增殖與侵襲[14]。靶向LncRNA HOTAIR 通過調節EMT 抑制口腔癌干細胞的癌干性和轉移[15]。盡管HOTAIR 已被證明在胃癌、肝癌、口腔癌的進展中發揮關鍵作用,但有關調控宮頸癌發展的分子機制的研究較少。本研究檢測了HOTAIR 在宮頸癌發展中的生物學功能,結果表明,過表達HOTAIR 顯著加快了細胞增殖和上皮細胞-間充質轉化(EMT),抑制了細胞凋亡;而下調HOTAIR 則抑制了細胞增殖,減少了細胞EMT,誘導了更多的細胞凋亡。由此得出,HOTAIR 可能是宮頸癌的一個潛在的生物標志物和治療靶點。

HOTAIR 作為內源競爭RNA(ceRNA)在各類腫瘤中可以與不同的微小RNA(miRNA)結合并發揮重要的調控作用。在卵巢癌中,HOTAIR 可以通過競爭結合miR-148a上調人類白細胞抗原-G(HLAG)的表達促進卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲[16]。在乳腺癌中,HOTAIR 可以通過與miR-20a-5p以及HMGA2形成的ceRNA 調控網絡影響乳腺癌的發生和發展[17]。在肺癌中,LncRNA-HOTAIR 通過上調miR-613影響非小細胞肺癌的發生和轉移[18]。據此推測在宮頸癌中,HOTAIR 是否也通過miRNA 發揮作用。本研究結果發現,HOTAIR 與miR-20a-5p之間存在靶向結合位點,HOTAIR 通過miR-20a-5p靶向調節宮頸癌進展。為了探討miR-20a-5p的下游分子機制,本研究采用TargetScan軟件進一步分析得出miR-20a-5p與KIF26B存在靶向結合關系。KIF26B是驅動蛋白超家族的成員之一,在腎臟的發育過程中起到非常重要的作用[19]。近年來有研究表明,KIF26B的下調抑制了乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。KIF26B 通過FGF2/ERK 信號通路促進乳腺癌細胞增殖和遷移。最后,本研究探討了KIF26B 在宮頸癌細胞中的表達量及發揮的關鍵作用,結果顯示,KIF26B在宮頸癌細胞中過表達,促進宮頸癌細胞增殖和EMT,抑制癌細胞凋亡。

綜上所述,本研究闡明了HOTAIR 通過其直接靶基因miR-20a-5p/KIF26B軸抑制宮頸癌細胞凋亡,促進宮頸癌細胞增殖和EMT。研究結果提示HOTAIR 可能作為一種潛在的生物分子標志物在宮頸癌進展中發揮作用。