共載紫杉醇與胡椒堿的固體脂質納米粒的體外藥物釋放

田思宇，韓新宇，任金妹，叢卉婧，崔欣冉，唐景玲*（.哈爾濱醫科大學藥學院，哈爾濱 50086；.復旦大學附屬中山醫院青浦分院，上海 0700）

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是迄今為止臨床抗腫瘤最有效的藥物之一，其抗腫瘤活性強，作用范圍廣。但紫杉醇的溶解性差，且存在耐藥性，紫杉醇口服給藥后會被腫瘤部位的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）外排，導致其口服給藥的生物利用度低。使用P-gp 抑制劑可以提高紫杉醇的口服生物利用度進而提高治療作用。胡椒堿（piperine，Pip）是胡椒的主要成分，是P-gp 的逆轉劑，但難溶于水，有研究表明胡椒堿和紫杉醇聯合應用后紫杉醇的生物利用度增加。傳統的紫杉醇劑型穩定性低、粒徑大、多分散指數高、制備工藝困難。固體脂質納米粒（SLN）是近年來被廣泛研究的給藥系統，SLN 以脂質作為載體材料將藥物包裹在其中，避免了藥物與外界環境接觸，增加了藥物的穩定性，延長了藥物的半衰期，同時也可將水溶性差的藥物包裹在脂質中。本文采用單硬脂酸甘油酯包載紫杉醇與胡椒堿制備成固體脂質納米粒（PP-SLN），以提高紫杉醇和胡椒堿的溶解度，進而提高其生物利用度并對該制劑進行體外釋放的評價。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 Infinity 液相色譜儀（美國Agilent公司）；SZCL-4 數顯智能恒溫磁力攪拌器（上海卓康生物科技有限公司）；KQ5200E 醫用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA124SCW 型電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；PHS-3C 實驗室pH 計（上海霄盛儀器制造有限公司）；HZQ-C 空氣浴振蕩器（哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）；Nano 微射流均質機（上海諾澤流體科技有限公司）。

1.2 試藥

PTX、Pip（美倫生物技術有限公司）；大豆磷脂（上海艾偉拓醫藥科技有限公司）；單硬脂酸甘油酯（嘉法獅上海貿易有限公司）；吐溫80（天津市富宇精細化工有限公司）；甲醇（山東禹王實業有限公司）；無水乙醇（天津市天力化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 PP-SLN 的制備

稱取一定量的PTX、Pip 和單硬脂酸甘油酯于西林瓶中，加入適量無水乙醇后于75 ℃水浴鍋中加熱使藥物和脂質溶解作為油相。稱取一定量Tween-80 和大豆磷脂于100 mL 燒杯中，加入25 mL 水于75℃的水浴鍋中加熱攪拌使助乳化劑溶解作為水相。當油相和水相全部溶解后，將油相緩慢滴加到水相中，保持溫度為75℃，繼續攪拌至無水乙醇揮干，使用高壓均質機使其分散均勻后于4℃條件下固化得到PP-SLN。制備的PPSLN 外觀澄清透明并伴有淡藍色乳光，并且在4℃放置24 h 后無明顯改變。

2.2 PP-SLN 的外觀形態

將一滴新鮮制備的PP-SLN 溶液滴到覆有支撐膜的銅網上，自然干燥，置于透射電子顯微鏡下觀察。PP-SLN 透射電鏡圖見圖1，PP-SLN 外觀為光滑的類球狀顆粒，無聚集與粘連，粒徑較小且分散良好。

圖1 PP-SLN 的透射電鏡圖Fig 1 Transmission electron microscopy of PP-SLN

2.3 PP-SLN 粒徑和Zeta 電位的測定

取新鮮制備的PP-SLN 10 μL 用去離子水稀釋至1 mL，輕輕混勻后使用NanoZS90 馬爾文激光粒徑分析儀對其粒徑及粒度分布進行測定。結果如圖2A 所示，PP-SLN 的粒徑為（53.72±1.43）nm，多分散指數（PDI）為0.208。取適量新鮮制備的PP-SLN，使用NanoZS90 馬爾文激光粒徑分析儀對其Zeta 電位進行測定。結果如圖2B 所示，PP-SLN 的Zeta 電位為（－19.4±3.31）mV。

圖2 PP-SLN 的粒徑（A）和Zeta 電位（B）結果Fig 2 Particle size（A）and Zeta potential（B）of PP-SLN

2.4 PP-SLN 的體外釋放研究

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（75∶25）；流速為1.0 mL·min；柱溫為30℃；檢測波長為227 nm；進樣量為20 μL。

2.4.2 溶液的配制

① 空白溶液（釋放介質）：配制含20%無水乙醇的PBS（pH 6.8）為空白溶液。

② 對照品溶液：精密稱定1 mg PTX 對照品，用釋放介質定容于10 mL 量瓶中，即得100 μg·mL的PTX 對照品母液。

③ 樣品溶液：取100 μL PP-SLN 溶液置10 mL 量瓶，使用含20%無水乙醇的PBS（pH 6.8）定容后，即得樣品溶液。

2.4.3 專屬性試驗 取“2.4.2”項下3 種溶液，進樣，考察方法專屬性。色譜圖如圖3 所示，藥物峰形尖銳且為單峰，釋放介質及微量雜質不干擾PTX 的含量測定，表明此方法專屬性良好。

圖3 紫杉醇色譜圖Fig 3 Chromatogram of paclitaxel

2.4.4 線性關系考察 根據信噪比大于20 來確定藥物的定量下限為1.0 μg·mL，根據信噪比等于3 確定檢測限為0.1 μg·mL。取“2.4.2”項下的對照品溶液，用釋放介質稀釋成1.0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 和18.0 μg·mL系列溶液，按“2.4.1”項下色譜條件，依序進樣并記錄峰面積，繪制標準曲線。結果回歸方程為：

A

＝38.36

C

＋6.5917，

r

＝0.9999，表明PTX 在1.0 ～18.0 μg·mL時與峰面積線性關系良好。2.4.5 精密度試驗 取“2.4.2”項下的對照品溶液，用釋放介質稀釋成低（3.0 μg·mL）、中（9.0 μg·mL）和高（15.0 μg·mL）3 種質量濃度的溶液，進樣分析。連續進樣5 次，測定日內精密度；連續5 d 進樣，測定日間精密度。結果表明日內、日間的

RSD

均小于2%，該方法的精密性符合要求。

2.4.6 回收試驗 吸取適量的釋放介質溶液，加入適量的PTX 對照品，制備低（3 μg·mL）、中（4.8 μg·mL）和高（6.0 μg·mL）3 種質量濃度的藥物溶液，進樣分析，計算3 種濃度的回收率。結果表明3 種濃度的回收率均在98%～102%，表明此方法的回收率滿足分析方法的要求，該方法準確性良好。

2.4.7 穩定性試驗 取供試樣品在0、2、4、6、8、10、24 h 時進樣，記錄峰面積，考察其放置穩定性。結果24 h 內PTX 含量的

RSD

小于2%，表明供試品溶液放置24 h 內其含量幾乎無變化，穩定性符合要求。2.4.8 PP-SLN 中PTX 的體外釋放研究方法 采用正向動態膜透析法，選擇含20%無水乙醇的PBS（pH 6.8）作為釋放介質，滿足漏槽條件。分別移取l mL 新制的PTX 混懸液和PP-SLN 至預先處理好的透析袋（截留分子量：8000 ～14 000）中，夾緊透析袋后放于盛有100 mL 釋放介質的燒杯中，將燒杯擺放在恒溫振蕩器內，溫度37 ℃，轉速100 r·min，分別于0.5、1、2、4、6、8、10、24、36 和48 h 用移液槍取1 mL 釋放介質，同時補充1 mL 新鮮備用介質。平行取樣3 組，進樣測定，記錄每個時間點對應的峰面積，計算累積釋放量。累積釋放量（

Q

）及累積釋放百分數（

Q

，%）由以下公式計算求得：

其中：

C

為在

t

時刻PTX 的測定濃度，

C

為

t

時刻之前測定的PTX 濃度，

V

為接受池中加入的溶液體積，

V

為每次取樣體積，

Q

為起始時給藥池中PTX 總量。PTX 混懸液和PP-SLN 在48 h 內的釋放結果如圖4 所示，PTX 混懸液中PTX 48 h 的累積釋放量約為30%，PP-SLN 中PTX 48 h 的累積釋放量約為76%。PP-SLN 與PTX 混懸液相比明顯增加了PTX 的體外釋放量。

圖4 PTX 在PP-SLN（A）及PTX 混懸液（B）中的累積釋放曲線（x± s，n ＝6）Fig 4 In vitro release curve of PTX from PP-SLN and PTX suspension（±s，n ＝6）

3 討論

本試驗采用溶劑揮發-高壓均質法制備的PP-SLN，外觀呈類球形，均勻分布，其粒徑為（53.72±1.43）nm，PDI 為0.208，該制劑提高了PTX 及Pip 的溶解度，減小了粒徑和多分散系數；PP-SLN 帶有一定的負電荷，在放置過程中不易發生凝聚、沉淀，有利于PP-SLN 的儲存。試驗另外測定PP-SLN 中PTX 的包封率高達98.4%，載藥量為6.02%（待另文發表）。體外釋放試驗以pH 6.8 的PBS 作為釋放介質是為了模擬腸液的環境，結果表明PP-SLN 與PTX 混懸液相比明顯增加了PTX 的體外釋放量。PTX 混懸液中的紫杉醇于24 h 達到最大釋放后，其累積釋放量不再增加，而PP-SLN 中的紫杉醇持續緩慢釋放，達到緩釋目的。本試驗制備的PP-SLN 達到預期增加紫杉醇口服生物利用度的目的，胡椒堿作為逆轉劑提高紫杉醇口服生物利用度的研究有著廣闊的發展前景。