LC-MS/MS法同時評價吲達帕胺對大鼠肝微粒體中6種CYP450酶活性的影響

李耕，杜薇，嚴菲，曹玲，陳民輝*（.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，南京 009；.廣東省婦幼保健院藥學部，廣州 50000）

藥物相互作用可能發生在藥效動力學和藥代動力學的各個階段，約40%的藥物是因為體內代謝數據不佳（如誘導或抑制藥物代謝酶等）而退出市場。因此，建立一種簡單、準確、快速、可靠的方法測定藥物代謝酶CYP450 酶活性尤為重要。CYP450 酶系是由多種同工酶組成的超級大家族，主要存在于肝臟中，本研究選用咖啡因、咪達唑侖、右美沙芬、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、氯唑沙宗等6 種藥物分別作為CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1 等6 種同工酶的探針底物，高效液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）同時檢測這6 種探針底物的濃度，通過其消耗量來反映微粒體中CYP450 酶的活性。

本研究選用吲達帕胺為模型藥物，使用已建立的方法考察其對CYP450 酶活性的影響，以期為其臨床聯合用藥提供基礎數據。吲達帕胺作為一種抗高血壓作用的利尿劑，常與血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑或鈣拮抗劑合用治療高血壓，由于其臨床聯合用藥的普遍性，藥物相互作用的風險較大，對藥物相互作用的研究是保證聯合用藥安全、有效、合理的基礎。筆者查閱了吲達帕胺代謝相關的文獻，Sun 等報道了吲達帕胺代謝轉化的路徑，證明了吲達帕胺的主要代謝器官為肝臟，主要代謝酶為CYP3A4，其次是CYP2C19 和CYP2C8。Wang 等從基因多態性角度研究了人群中吲達帕胺代謝的差異性，發現了另一可能參與代謝的酶亞型為CYP2C9。Yan 等研究了7 種抗高血壓藥在體外肝微粒體孵育時對吲達帕胺生物轉化的影響；但這些研究均為CYP450 酶對吲達帕胺代謝的作用和影響，均未涉及吲達帕胺對CYP450 酶活性（誘導或抑制）的影響。因此，本研究初步篩查了吲達帕胺對CYP450 酶亞型的影響，以期為聯合用藥時吲達帕胺對其他合用藥物的潛在影響進行預測和評估。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Finnigan TSQ Quantum Discovery MAX 液質聯用系統（美國Thermo 公司）；Eppendorf 5430R 高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；－80℃超低溫冰箱（美國Thermo 公司）；XW-80A 旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠）；HH-2 數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

1.2 試藥

甲苯磺丁脲（批號：100500-200801）、氯唑沙宗（批號：100364-201302）、咖啡因（批號：171215-201009）（對照品，中國食品藥品檢定研究院）；氫溴酸右美沙芬（批號：6114151012）、奧美拉唑（批號：6013160301）（江蘇恒瑞醫藥）；枸櫞酸莫沙必利（批號：MS-105-150904）、格列吡嗪（批號：G-120-150626）（江蘇豪森藥業）；馬來酸咪達唑侖（D02-20141203，江蘇恩華藥業）；吲達帕胺（批號：150805，天津藥物研究院）；上述對照品或原料藥純度均大于 98.0%。其他試劑均購于默克或Sigma 公司。

大鼠肝微粒體為實驗室自制，通過考馬斯亮藍法測得微粒體中的蛋白含量為19.5 mg·mL。制備所需的雄性SD 大鼠為SPF 級，體質量為180 ～220 g，由南京市青龍山動物養殖中心提供，動物合格證號：SCXK（蘇）2014-0001。

2 方法與結果

2.1 標準溶液的配制

分別精密稱取氫溴酸右美沙芬、馬來酸咪達唑侖、咖啡因、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲適量，用甲醇溶解稀釋，分別定量制成濃度分別為20、20、40、40 和100 mmol·L的單標儲備液。精密稱取奧美拉唑適量，用1 mmol·LNaOH的水溶液-甲醇（1∶1）溶解稀釋，定量制成20 mmol·L的單標儲備液。上述6 種儲備液于4℃冷藏保存，臨用時按需用去離子水稀釋成相應濃度的混合探針標準工作液。

分別精密稱取枸櫞酸莫沙必利、格列吡嗪對照品適量，用甲醇溶解并稀釋，定量制成1.0 mg·mL的單標儲備液，于4 ℃冷藏保存，臨用時按需用甲醇稀釋成相應濃度的混合內標標準工作液。

2.2 LC-MS/MS 測定條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse SB-C（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動相為甲醇-0.1%甲酸＝55∶45（

V

/

V

）； 流速：0.2 mL·min；柱溫：35℃，進樣量：5 μL。

2.2.2 質譜條件 在電噴霧電離（ESI）條件下，采用多反應監測模式（MRM），4.1 min 時由正離子檢測切換至負離子檢測。毛細管溫度為250℃，鞘氣（N）壓力為25 bar，輔助氣（N）壓力為5 bar，碰撞氣（Ar）壓力為1.5 mTorr，其他質譜參數詳見表1。

表1 6 種底物及內標的質譜條件參數
Tab 1 Parameters of mass spectrometry for 6 substrates and internal standards

化合物名稱電離方式MRM/（m/z）保留時間/min噴霧電壓/kV碰撞能/eV CYP1A2咖啡因ESI＋195.0 →138.02.3＋3.519 CYP3A4氫溴酸右美沙芬ESI＋272.0 →171.02.8＋3.539 CYP2D6馬來酸咪達唑侖ESI＋326.0 →291.03.0＋3.524 CYP2C9奧美拉唑ESI＋346.0 →198.03.4＋3.521內標枸櫞酸莫沙必利ESI＋422.0 →198.02.4＋3.521 CYP2C19氯唑沙宗ESI－168.0 →132.05.1－3.022 CYP2E1甲苯磺丁脲ESI－269.0 →170.06.8－3.027內標格列吡嗪ESI－444.1 →319.09.2－3.020酶

2.3 樣品處理

取孵育體系樣品200 μL，置1.5 mL 高速離心管中，精密加入混合內標標準工作液200 μL，加入甲醇600 μL，渦旋2 min 混勻，16 000 r·min，4℃離心10 min，取上清液，在16 000 r·min，4℃離心10 min，轉移上清液，供LC-MS/MS 分析。

2.4 孵育實驗

微粒體孵育體系的總體積為200 μL，包括肝微粒體蛋白（0.2 ～2 mg·mL），0.1 mol·LPBS 緩沖液，10 mmol·LMgCl，混合探針藥物（咖啡因、氫溴酸右美沙芬、馬來酸咪達唑侖、奧美拉唑、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲濃度分別為16、8、8、8、32 和40 μmol·L），以及NADPH 發生體系（由10 mmol·L葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽，0.5 mmol·LNADPNa和1 U·mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成）。在加入NADPNa前，將孵育體系在37℃下預孵育5 min，加入NADPNa啟動反應并計時。在一定時間（5 ～120 min）后，孵育體系按“2.3”項下方法操作，終止孵育反應，處理樣品并進樣分析。

2.5 方法學驗證

2.5.1 空白孵育體系樣本的制備 制備含0.2 mg·mL的肝微粒體蛋白、0.1 mol·L的PBS緩沖液、10 mol·L的MgCl以及NADPH 發生體系（由10 mol·L葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽，0.5 mol·LNADPNa和1 U·mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成）的混合液，置 37℃水浴30 min 后，混勻，作為空白孵育體系樣本。

2.5.2 專屬性考察 分別取空白孵育體系樣本，空白孵育體系樣本添加探針底物（咖啡因、氫溴酸右美沙芬、馬來酸咪達唑侖、奧美拉唑、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、枸櫞酸莫沙必利和格列吡嗪對照品的標準溶液）適量，以及探針底物孵育體系樣品，照“2.3”項下方法操作，進樣分析。典型色譜圖如圖1 所示，結果表明空白孵育體系樣本中共存物不干擾色譜分析。

圖1 典型色譜圖Fig 1 Typical chromatogram

2.5.3 標準曲線及最低檢測限（LOD） 精密吸取20 μL 混合探針標準工作液，置1.5 mL 高速離心管中，加入空白孵育體系樣本180 μL，混勻，制成咖啡因、氫溴酸右美沙芬、馬來酸咪達唑侖、奧美拉唑、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲濃度分別為0.04 ～20、0.02 ～10、0.02 ～10、0.02 ～10、0.08 ～40 和0.1 ～50 μmol·L的標準孵育樣品（每個樣品200 μL），照“2.3”項下方法操作，進樣分析。記錄待測物色譜峰面積（

A

）與內標色譜峰面積（

A

），以峰面積比

R

（

R

＝

A

/

A

）對濃度（

C

，μmol·L）進行線性回歸。由于標準曲線最低點的色譜圖的各待測物峰的信噪比

S/N

均＞10，因此以標準曲線最低點的濃度作為定量限（LOQ）；繼續制成更低濃度的標準孵育品，處理后進樣分析，以峰信噪比

S/N

≥3 時的濃度為LOD，結果見表2。6 種底物探針的標準曲線的相關系數均大于0.995，線性關系良好；6 種底物探針的LOD 均在其標準曲線最低點濃度的25%及以下，方法靈敏度高。

表2 6 種底物探針的標準曲線方程及定量限檢測限
Tab 2 Standard curve equation，limit of quantitation and detection for 6 substrate probes

探針底物標準曲線相關系數 線性范圍/（μmol·L－1） 定量限/（μmol·L－1） 檢測限/（μmol·L－1）咖啡因C ＝1.9236R－0.02770.99860.04 ～200.040.01氫溴酸右美沙芬C ＝0.7266R－0.01780.99760.02 ～100.020.005馬來酸咪達唑侖C ＝0.4645R－0.00350.99950.02 ～100.020.002奧美拉唑C ＝0.6904R－0.02260.99690.02 ～100.020.001氯唑沙宗C ＝0.8070R ＋0.00410.99580.08 ～400.080.02甲苯磺丁脲C ＝0.7684R ＋0.03040.9989 0.1 ～500.10.025

2.5.4 準確度和精密度 分別精密吸取20 μL 低中高三種濃度水平的混合探針標準工作液，置1.5 mL 高速離心管中，加入空白孵育體系樣本180 μL，混勻，制成含咖啡因、氫溴酸右美沙芬、馬來酸咪達唑侖、奧美拉唑、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲分別為0.1、0.05、0.05、0.05、0.2 和0.25 μmol·L，1、0.5、0.5、0.5、2 和2.5 μmol·L，16、8、8、8、32 和40 μmol·L的三種濃度水平標準孵育樣品（每個樣品200 μL）。照“2.3”項下方法操作，進樣分析。在一個分析批內測定5次，計算批內精密度；在不同天制備并測定3 個分析批，計算批間精密度。結果顯示，6 種底物探針的準確度在93.66%～107.59%，批內批間

RSD

均≤7.9%，方法的準確度、精密度良好，符合生物樣本的測定要求。2.5.5 提取回收率 同“2.5.4”項下方法制備，每個濃度水平各5 份，即得回收率供試液。另分別取200 μL 空白孵育體系樣本經甲醇沉淀處理后，取上清液，再加入與回收率供試液等量的混合探針標準工作液和混合內標標準工作液，經渦旋混勻和高速離心后，獲得上清液，每個濃度水平各2 份。計算提取回收率供試組與提取回收率對照組的峰面積比值，即得樣品處理方法的提取回收率。結果6 種底物探針的高、中、低濃度的平均提取回收率均＞90%，且穩定（5 份樣品提取回收率的

RSD

值均≤7.0%）。2.5.6 基質效應 基質供試組：與“回收率對照組”同法制備，每個濃度水平各5 份。基質對照組：取甲醇-水（3∶1）精密加入與基質供試組等量的混合探針標準工作液和混合內標標準工作液，配制成三個濃度水平的溶液。基質效應為基質供試組峰面積與基質對照組峰面積的比值，用以考察不可見干擾（即共流出成分，主要指內源性成分）對待測物和內標物離子化效率的影響，內標的基質效應均在87.03%～110.08%，6 種底物探針的基質效應均在93.02%～105.23%，

RSD

值均≤10.4%，表明生物基質對樣品和內標的質譜響應均無影響。

2.5.7 穩定性

① 標準溶液穩定性試驗：取咖啡因、氫溴酸右美沙芬、馬來酸咪達唑侖、奧美拉唑、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲單標儲備液稀釋成濃度分別為0.4、0.2、0.2、0.2、0.8、1 μmol·L的混合探針標準工作液；取1.0 mg·mL枸櫞酸莫沙必利和格列吡嗪單標儲備液稀釋成質量濃度分別為200 ng·mL和300 ng·mL的混合內標標準工作液。將上述標準工作液在室溫放置0、4、8 h 后進樣分析，用以考察標準工作液的穩定性。將以上單標儲備液置于4 ℃冰箱中冷藏7 d 后，再稀釋成上述濃度的標準工作液后分析，用以考察標準儲備液的穩定性。

② 自動進樣器放置穩定性：將“2.5.4”項下三種濃度水平的樣品溶液于自動進樣器（15 ℃）中放置0、4、8、12 和24 h 后進樣分析，用以考察樣品溶液的穩定性。

穩定性試驗結果表明混合標準工作液和混合內標工作液在室溫放置8 h 以及各單標儲備液冷藏放置7 d 均穩定；樣品溶液在自動進樣器中放置24 h 穩定。

2.6 模型藥物吲達帕胺對大鼠CYP450 酶的影響研究

2.6.1 孵育條件的選擇 考察不同微粒體蛋白質量濃度（0.2、0.5、1.0 和2.0 mg·mL）和不同反應時間（5、10、20、30、60 和120 min），照“2.4”項下方法操作。根據已確立的分析方法測定探針底物的濃度（

C

）和初始濃度（

C

），根據探針底物的消耗計算其代謝轉化率（

R

）：

R

＝（

C

－

C

）/

C

。合適的孵育條件為探針底物具有適中的代謝轉化率，最終確定孵育條件如表3。

表3 各探針藥物最終確定的孵育條件
Tab 3 Final incubation condition for each probe drug

探針藥物孵育條件微粒體蛋白質量濃度/（mg·mL－1）反應時間/min馬來酸咪達唑侖0.210氫溴酸右美沙芬、奧美拉唑、氯唑沙宗0.530咖啡因、甲苯磺丁脲1.060

2.6.2 正式孵育實驗 按“2.6.1”項下確定的3個孵育條件進行。實驗分為對照組和實驗組。對照組含“2.4”項下的孵育體系，不含吲達帕胺；實驗組在對照組孵育體系基礎上，還包含吲達帕胺，濃度分別為0.2、0.5、2、5、20、50 和200μmol·L。每組平行3 份，按已確立的分析方法測定每份孵育樣品中咖啡因、氫溴酸右美沙芬、馬來酸咪達唑侖、奧美拉唑、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲的濃度。

2.6.3 孵育實驗結果 根據測得的不同樣品的探針藥物剩余濃度（

C

）和已知的初始濃度（

C

），計算代謝轉化率

R

。以對照組的探針代謝轉化率（

R

）為100%，計算不同實驗組的相對代謝轉化率（

R

）：

R

＝

R

/

R

×100%。吲達帕胺對6 種探針底物代謝的影響如圖2 所示。所得結果經單因素方差分析及多重組間比較（SPSS 11.5），

P

＜0.05 表示差異有統計學意義，結果見圖2。與對照組相比，在吲達帕胺濃度為0.02 ～200 μmol·L，實驗組中咪達唑侖、右美沙芬、咖啡因的相對代謝率差異均無統計學意義（

P

＞0.05）；當吲達帕胺增加至200 μmol·L時，甲苯磺丁脲的相對代謝率和氯唑沙宗的相對代謝率明顯降低（

P

＜0.05，

P

＜0.01）；當吲達帕胺增加至50、200 μmol·L時，奧美拉唑的相對代謝率明顯降低（

P

＜0.01）。因此，吲達帕胺對CYP3A4、CYP2D6 和CYP1A2 無抑制作用，對CYP2C9 和CYP2E1 有潛在抑制作用（半數抑制濃度

IC

均＞50 μmol·L，可認為基本無抑制作用），對CYP2C19 有抑制作用。

圖2 吲達帕胺對探針底物在肝微粒體內代謝轉化率影響Fig 2 Effect of indapamide on the metabolic conversion rate of probe substrates in liver microparticles

3 討論

本研究建立了LC-MS/MS 法同時評價肝微粒體中6 種CYP450 酶活性的方法，經過系統的方法學驗證，具備簡單、準確、快速、可靠等優點。通過流動注射方式對各待測物的質譜條件進行了優化，6 種探針底物在正負離子模式分時間段檢測，優化的質譜條件響應良好。待測物和內標保留時間合適，靈敏度高，峰形尖銳，可在一次進樣分析過程中完成正負模式切換，單針分析時間僅為11 min，提高了高通量樣本分析效率，且樣品前處理簡便。與已報道的LC-UV 方法比較，更加省時高效，適合用于快速評估藥物對CYP450 酶活性的影響。

臨床常見的藥物相互作用主要出現在體內代謝過程中，主要是由CYP450 酶介導的，研究藥物對CYP450 酶的影響可以預測潛在的藥物相互作用。吲達帕胺為常用的降壓用利尿劑，臨床聯合用藥普遍，并且其體內代謝途徑復雜，是多種CYP450 同工酶的底物，其發生藥物相互作用的風險較大。目前未見有吲達帕胺對CYP450 酶活性影響的研究，但其在聯合用藥中不良反應時有發生。本研究首次測定了吲達帕胺對CYP450 酶的影響，發現吲達帕胺對CYP2C19 活性有抑制作用。因此，當合用藥物經CYP2C19 代謝時，可能導致藥物的血藥濃度升高而產生不良反應。但是本研究僅對同吲達帕胺合用時具有潛在不良反應的藥物進行初篩，具體的藥物尚需體內研究和臨床試驗加以確證。