Cav-1對EGFR敏感基因突變非小細胞肺癌患者厄洛替尼治療耐藥的機制研究

高冬梅，張小芳，安 杰，范 婧，劉靜普

肺癌發生、發展、轉移及復發是多步驟、多因素參與的復雜過程，受多個信號通路調節。目前肺癌的治療已由原來根據組織類型進行化、放療，步入到根據基因類型分類的精準化治療年代。針對表皮生長因子受體(EGFR)敏感基因突變非小細胞肺癌(NSCLC)患者應用表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)治療，已成為目前該類型肺癌的一線標準治療方案。伴隨研究的進展，治療后耐藥問題也備受關注。目前已明確的EGFR-TKIs治療后耐藥機制主要包括旁路激活、靶基因突變、組織學轉化等途徑[1-5]，其中MAPK/ERK信號通路是一條重要的旁路激活通路[6-7]，但其激活機制尚未完全明了。本研究通過觀察小凹蛋白-1(Cav-1)在肺癌細胞耐藥前后的表達變化及其與信號通路活化的關系，探討EGFR-TKIs的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1主要材料和儀器 收集2012—2019年我院收治的30例肺腺癌臨床資料，經基因檢測證實存在EGFR敏感基因突變，均留存確診活檢標本(治療前組織)，接受一代EGFR-TKIs治療且治療有效，治療出現耐藥并已重新獲取組織標本。NSCLC細胞株PC-9(美國哥倫比亞大學惠贈)，PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1(本室保存)，厄洛替尼(美國ROCHE公司)，兔抗p-ERK1/2多克隆抗體、兔抗EGFR單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，兔抗Cav-1抗體、鼠抗Cav-1單克隆抗體、兔抗ERK多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，鼠抗磷酸化酪氨酸單克隆抗體(4G10)購自美國Millipore公司；BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierces)。本研究經我院醫學倫理委員會審核通過。

1.2研究方法

1.2.1免疫組織化學染色法檢測Cav-1表達：將收集到的患者活檢組織切片(3～5 μm)置于防脫玻片上，常規脫蠟至水，滅活內源性過氧化物酶；EDTA修復抗原；滴加一抗(1︰200稀釋鼠抗人Cav-1單克隆抗體)；4 ℃冰箱過夜；沖洗后滴加二抗，2 h后沖洗，DAB顯色，復染。染色過程均設陰陽性對照。光鏡下觀察，腫瘤細胞膜著棕黃色或棕色定義為陽性細胞。隨機選取500個腫瘤細胞，計算陽性細胞比率。陽性細胞數>25%為陽性。

1.2.2MTS比色分析法檢測細胞增殖能力：將PC-9/Cav-1及PC-9/pcDNA3.1等濃度接種于96孔板，空白培養基調零，每株細胞設3個復孔，孵箱培養24 h，棄去培養基，分別加入200 μl濃度為0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 μmol/L的厄洛替尼培養液繼續培養48 h。用酶標儀檢測490 nm波長處吸光度值。計算細胞生長抑制率，繪制不同濃度下細胞生長抑制率曲線圖，計算厄洛替尼的半抑制濃度(IC50)值。

1.2.3Transwell法檢測厄洛替尼對穩定轉染細胞侵襲能力的影響：將解凍后的基質膠與無胎牛血清的1640培養液渦旋混勻，將基質膠均勻鋪在小室底部，上、下室分別加入無胎牛血清1640培養液100 μl和10%胎牛血清1640培養液600 μl，將處于對數生長期的PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細胞株饑餓4 h，消化細胞，分別用無胎牛血清的1640培養液及含0.04 μmol/L厄洛替尼的無胎牛血清1640培養液重懸細胞。分別取200 μl細胞懸液加入上室(各加入3個小室)，使細胞均勻鋪在小室底部，培養箱培養48 h。取下室常規HE染色，在200×光鏡下，隨機選取5個視野，統計穿膜細胞數。

1.2.4Western blot法檢測MAPK/ERK信號通路活化程度：消化對數生長期PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細胞，接種在35 mm培養皿中培養24 h，再在含0.04 μmol/L厄洛替尼的1640培養液中培養0、4 h后收集細胞，提取蛋白檢測Cav-1、pY-EGFR(4G10)、EGFR、p-ERK、ERK、β-actin表達。掃描膠片并用Image J圖像分析系統分析。

2 結果

2.1Cav-1表達情況 耐藥前Cav-1陽性表達16例(53.3%)，而耐藥后增多至26例(86.7%)，比較差異有統計學意義(P<0.01)。與EGFR-TKIs治療耐藥前比較，耐藥后肺癌組織中Cav-1表達陽性率及表達強度增高或增強。見圖1。

圖1 EGFR敏感基因突變的非小細胞肺癌患者厄洛替尼治療耐藥前后癌細胞Cav-1表達情況(免疫組織化學染色，10×10)

2.2厄洛替尼對穩定轉染細胞株抑制能力的影響 MTS比色分析法檢測結果顯示，不同濃度厄洛替尼對PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1的抑制率不同，同一濃度下，PC-9/Cav-1組細胞抑制率明顯低于PC-9/pcDNA3.1組(P<0.05)，見圖2；PC-9/Cav-1組厄洛替尼IC50值明顯高于PC-9/pcDNA3.1組(P<0.05)，見圖3。

圖2 厄洛替尼對EGFR敏感基因突變非小細胞肺癌患者不同Cav-1表達細胞株的抑制率比較

圖3 EGFR敏感基因突變非小細胞肺癌患者不同Cav-1表達細胞株厄洛替尼IC50值比較

2.3穩定轉染細胞侵襲能力的變化 通過Transwell 法檢測不同藥物濃度下穩定轉染Cav-1質粒的PC-9細胞。在無厄洛替尼作用下PC-9/Cav-1組穿膜細胞數明顯多于PC-9/pcDNA3.1組(P<0.05)；在0.04 μmol/L厄洛替尼作用下，PC-9/Cav-1組穿膜細胞數明顯多于PC-9/pcDNA3.1組(P<0.05)。見圖4。

圖4 EGFR敏感基因突變非小細胞肺癌患者不同Cav-1表達細胞株侵襲能力比較

2.4穩定轉染細胞對EGFR活化及其下游信號通路的活化作用比較 采用Western blot法檢測穩定轉染Cav-1及未轉染Cav-1的EGFR蛋白及其下游蛋白磷酸化表達水平。結果顯示：PC-9/Cav-1組pY-EGFR及p-ERK表達水平明顯高于PC-9/pcDNA3.1組(P<0.05)，見圖5。

圖5 EGFR敏感基因突變非小細胞肺癌患者Western blot法檢測MAPK/ERK信號通路活化程度

3 討論

2009年《The New England Journal of Medicine》IPASS研究結果公布開啟了肺癌治療的新篇章，2021年7月EVIDANCE研究結果公布[8]，證明EGFR-TKIs無論是在EGFR敏感突變的晚期NSCLC治療中還是在早期患者的輔助治療中均具有重要地位。EGFR敏感基因突變NSCLC EGFR-TKIs治療患者無疾病進展生存期明顯長于予含鉑雙藥化療患者，因此EGFR-TKIs已成為EGFR敏感基因突變NSCLC的一線治療方案。

目前國內外多種EGFR-TKIs藥物相繼上市，不同患者明顯受益，故相關耐藥機制研究就顯得尤為重要。旁路激活被認為是導致第一代EGFR-TKIs耐藥的重要因素[2]。既往研究表明，MAPK/ERK是旁路激活導致腫瘤細胞耐藥的重要信號通路，該信號通路活化受多種因素影響[7,9-10]。小凹蛋白是細胞質膜上Ω型結構，具有膜運輸、脂質代謝和細胞信號傳導等基本作用[11]。Cav-1是細胞質膜上Ω型小凹蛋白的主要組成蛋白，在腫瘤細胞免疫應答、內吞作用、膜轉運、細胞信號傳導等方面發揮多重作用[12-15]。有研究表明，Cav-1異常表達與肺癌細胞增殖、遷移、凋亡和耐藥等密切相關[16]。在肺癌、結腸癌、腎癌、食管癌等多種惡性腫瘤中，Cav-1高表達與腫瘤化療耐藥有關[17-19]。在紫杉醇耐藥的A549細胞中，下調Cav-1表達可導致Bax增加和Bcl-2降低進而誘導細胞凋亡，從而逆轉細胞對紫杉醇耐藥[20]。在對BRAF抑制劑治療轉移性惡性黑色素瘤的研究中發現，ERK信號通路激活是導致治療耐藥的主要原因[21]。然而也有研究認為， Cav-1高表達可促進白蛋白結合型紫杉醇進入H23肺癌細胞，從而促進細胞凋亡，而降低Cav-1表達后，這些細胞出現了耐藥性[22]。雖然目前Cav-1與肺癌化療耐藥機制未完全明了，但是上述研究均表明，Cav-1表達與肺癌化療耐藥有關。在分子靶向治療中，Cav-1與耐藥機制的相關研究也在進行。在對吉非替尼、厄洛替尼敏感的PC-9細胞中，下調Cav-1表達后p-EGFR、p-ERK和p-AKT表達下降，細胞增殖和遷移能力減弱，對吉非替尼和厄洛替尼敏感性增加[23]。本研究通過對EGFR敏感基因突變NSCLC患者EGFR-TKIs治療耐藥前后腫瘤組織Cav-1表達情況分析發現，治療耐藥后腫瘤組織Cav-1表達水平升高及表達強度明顯增強，表明Cav-1高表達導致肺癌細胞對EGFR-TKIs耐受性增強，可能與患者治療耐藥相關。當對厄洛替尼敏感的EGFR敏感基因突變的PC-9細胞Cav-1過表達時，該細胞株對厄洛替尼耐受性增強，表明Cav-1高表達與肺癌EGFR-TKIs治療耐藥相關，是導致腫瘤耐藥的一個重要因素。

MAPK/ERK作為經典MAPK信號通路，已證實可被多種激酶激活，同時有多種蛋白參與其信號傳導過程[24]。本研究發現，Cav-1高表達時，細胞對厄洛替尼耐受性增加，細胞侵襲能力增強，同時發現MAPK信號通路pY-EGFR和p-ERK磷酸化水平升高，推測Cav-1參與了該信號通路的激活，ERK信號通路激活與肺癌細胞株對厄洛替尼耐受性增加有關，且ERK信號通路激活使得肺癌細胞株具有更強的侵襲能力，但其激活MAPK/ERK信號通路的具體機制還有待進一步研究。

綜上，Cav-1在EGFR-TKIs耐藥過程中扮演著重要角色，其過表達可引起EGFR-TKIs耐藥、細胞侵襲能力增強，耐藥機制可能與MAPK/ERK信號通路激活有關。Cav-1有望成為EGFR-TKIs耐藥的有效預測蛋白及潛在治療靶點。