高壓納秒脈沖電場的細胞器生物電效應綜述*

郭雨怡 石富坤 王群 季振宇 莊杰?

1) (中國科學技術大學生物醫學工程學院(蘇州)生命科學與醫學部,蘇州 215000)

2) (中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所,蘇州 215000)

3) (空軍軍醫大學軍事生物醫學工程學系,西安 710032)

1 引言

高壓脈沖電場(pulsed electric fields,PEFs)能夠在毫秒到皮秒的時間尺度內以極高的瞬時功率(可達百兆瓦量級)將電場能量施加到生物細胞和組織上,產生多種非線性生物效應,其中最典型的是細胞膜對親水性大分子的通透性顯著增加,即電穿孔(electroporation,EP).毫秒級和微秒級的PEFs 已經被廣泛應用于污水處理[1,2]、食品保鮮[3,4]、生物育種[5,6]、腫瘤電化學治療[7-10]和軟組織非熱消融[11,12]等領域.脈沖寬度更窄、場強更高的高壓納秒脈沖電場(nanosecond pulsed electric fields,nsPEFs)不僅能夠導致細胞膜穿孔,還可以穿透細胞膜直接作用于細胞內部,造成細胞器膜穿孔[13]、細胞骨架解聚[14]、胞內鈣離子釋放[15]、DNA 損傷[16]等效應,在誘導癌細胞凋亡[17,18]、促進干細胞分化[19,20]以及神經調控[21-23]等領域展現出廣闊的應用前景.

20 世紀50 年代,Stampfli[24]在實驗中觀察到高壓電場作用后細胞膜對親水性大分子的通透性顯著增加.1982 年,Neumann 等[25]將PEFs 作用下細胞膜通透性增加的現象稱為EP.EP 的產生機理是PEFs 對細胞膜充電,導致跨膜電壓超過磷脂雙分子層介電擊穿的閾值(約1 V),細胞膜生成大量缺陷,缺陷處的磷脂分子發生倒轉,從而在細胞膜上產生親水性微孔[26,27].圖1 為細胞膜EP 的結構示意圖,其中磷脂分子親水性的一端朝外,親油性的一端朝內.

圖1 PEFs 導致的細胞膜EP 示意圖Fig.1.Schematic diagram of PEF-induced membrane electroporation.

依據細胞膜上的穿孔恢復與否可進一步將EP 劃分為可逆電穿孔(reversible electroporation,RE)和不可逆電穿孔(irreversible electroporation,IRE)[12,28].RE 指PEFs 作用后細胞膜上的微孔在細胞活性未受影響前閉合,已用于藥物分子和基因導入[29];IRE 指PEFs 作用后細胞膜上微孔無法閉合,導致細胞內物質泄漏,對細胞造成不可逆的傷害,已被應用于實體腫瘤消融等領域[30-32].

為了研究nsPEFs 與細胞膜和細胞內結構相互作用的電學機制,Schoenbach 等[13]針對處于電極之間的真核細胞建立了如圖2 所示的等效電路模型.該等效電路模型包含了最主要的細胞結構,即細胞膜、細胞質和細胞核膜及細胞核質.細胞質和細胞核質含有豐富的離子從而具有明顯的電阻特性,膜結構由于磷脂雙分子層內部的疏水性而具有電容特性[33].由于核膜是雙層膜而細胞膜為單層膜,可簡化認為核膜電容量約為細胞膜電容的一半,相應的核膜充電時間常數較細胞膜充電時間常數更大[34].因此短于細胞膜充電時間常數的nsPEFs可能造成核膜[35]等細胞器膜產生電穿孔,導致線粒體[36-38]、內質網[39,40]、溶酶體[41,42]等細胞器的結構和功能改變,進一步引發鈣離子濃度增加、活性氧產生、細胞凋亡機制激活等次級效應,以上細胞器生物電效應也被稱為細胞內電處理效應(intracellular electromanipulation,IEM)[43-45].IEM是nsPEFs 與傳統微秒、毫秒PEFs 生物電效應的顯著區別.據本文作者調研,目前尚未有專門針對nsPEFs 的細胞器生物電效應的綜述報道.因此本文就nsPEFs 影響細胞器的功能結構變化及作用機制的研究展開綜述.

圖2 PEFs 中哺乳動物細胞等效電路模型Fig.2.Equivalent circuit model for the mammalian cells with the exposure to PEFs,where individual subcellular components are described by a combination of the resistor or capacitor.

為了確保充足的參考文獻,本文的搜索基于以下電子數據庫:PubMed (美國國家醫學圖書館,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed); Scopus Elsevier (http://www.scopus.com/);科學網(Thomson Reuters,http://apps.webofknowledge.com/);Google Scholar (https://scholar.google.com/).本文參考文獻主要包括從2000 年起至今所發表的nsPEFs對細胞器作用的相關文獻.

圖3 給出了收集到的nsPEFs 的細胞器生物電效應的發文量,自2000 年至今,發文量隨著時間呈現明顯的上升趨勢,說明近年來nsPEFs 的細胞器生物電效應的研究吸引了學者們更多的關注.

圖3 NsPEFs 細胞器效應的文獻發表情況Fig.3.Literature research about the intracellular effects for cells exposured to nsPEFs.

文章具體檢索包括關鍵詞及其組合的中英文,以及領域內重要研究者名單.中文平臺搜索關鍵詞為:(nsPEF OR 納秒脈沖電場 OR 超短脈沖電場OR 陡脈沖電場 OR 亞微秒脈沖電場)AND(細胞器 OR 細胞內 OR 細胞骨架 OR 線粒體 OR 內質網 OR 囊泡 OR 液泡 OR 核膜 OR 細胞核 OR溶酶體 OR DNA OR 鈣離子 OR 蛋白質);英文搜索關鍵詞為:(nsPEF OR nanosecond OR ultrashort OR submicrosecond OR electrical pulse)AND (organelles OR intracellular OR cytoskeleton OR mitochondria OR endoplasmic reticulum OR vesicle OR vacuole OR nuclear OR lysosome OR nucleus OR DNA OR calcium OR proteins) OR nanoelectroporation OR supraelectroporation.為盡量減少遺漏業內重要研究者的研究,在關鍵詞檢索搜集到的文章中,找到本研究領域內引文量高的文章,并對作者及同機構其他學者的文章再進行檢索篩選;最后,在Google Scholar搜索引擎中對上述關鍵詞再進行檢索,找到遺漏的文章.通過以上的文獻檢索方法盡可能確保文獻收集工作的準確性和完整性.

2 高壓納秒脈沖電場的細胞器生物電效應

如上節所述,細胞膜、細胞核、細胞器等亞細胞結構有特定的介電性質,從而可以建立細胞的等效電路模型以描述nsPEFs 的細胞器生物電效應.除了基于充電時間常數的描述,米彥[46]基于等效電路和單細胞殼層介電模型仿真在頻域分析細胞膜和核膜跨膜電位,得到細胞的頻率響應特性,發現當PEFs 攜帶頻率超過1 MHz 的分量時即可影響細胞核膜.

針對nsPEFs 的細胞器生物電效應的相關研究采用了脈寬從幾納秒到幾百納秒,場強從幾kV/cm 到幾百kV/cm 的PEFs 參數,作用對象包括來源于人和動物多種器官的癌細胞或正常細胞.該脈寬范圍包含了幾MHz 到幾百MHz 的頻率分量,從而可以影響細胞器.相關研究文獻所用PEFs參數和觀察到的細胞器變化[15-18,34,36,39-42,46-101]總結于表1,從表1 可以看出大多數研究關注細胞骨架、線粒體、內質網、細胞核等亞細胞結構.因此本文將依次分類闡述nsPEFs 與上述各細胞器的相互作用,最后綜合討論nsPEFs 對其他亞細胞結構的效應.

表1 nsPEFs 的細胞器生物電效應總結Table 1.Summary of effects of nsPEFs on cell organelles.

表1 （續）nsPEFs 的細胞器生物電效應總結Table 1 (continued).Summary of effects of nsPEFs on cell organelles.

3 細胞骨架相關變化

3.1 NsPEFs 影響細胞骨架完整性

細胞骨架是一種由蛋白纖維組成的網狀結構,主要由肌動蛋白(actin,AT)、微管(microtubules,MT)、中間絲(intermediate filaments,IFs)等組成[102].細胞骨架作為細胞形貌和力學性能的支撐結構,與多種細胞結構和功能相關,在細胞貼壁、增殖分化、信號傳導、遷移和細胞存活等方面發揮重要作用[103,104].

研究表明,nsPEFs 對AT,MT 和IFs 都會造成影響[14,105].Bergh?fer 等[48]對煙草細胞BY-2 施加10 ns,約33 kV/cm 電脈沖后,觀察到肌動蛋白絲向細胞核收縮從而導致細胞核形態發生變化.Steuer 等[61]對大鼠肝上皮細胞(WB-F344)施加20 個100 ns,20 kV/cm 的脈沖,發現肌動蛋白纖維的完整性和有序性在脈沖電場刺激完5—30 min內遭到破壞,隨后逐步恢復.該項研究同時觀察到細胞間連接直接通信功能被抑制,但由于使用的熒光標記方法耗時較長,并且對低劑量刺激不敏感,難以判斷肌動蛋白變化的明確機理.Chafai 等[56,57,106]在2019 和2020 年的研究中指出,使用超分辨平臺觀察到,nsPEFs 會改變MT 蛋白的瞬時構象,通過控制nsPEFs 參數,能夠控制MT 蛋白自組裝的進行.這種控制策略不僅對功能和結構生物學過程至關重要,也為合成納米材料提供了新的思路.

NsPEFs 導致的細胞骨架變化的機理目前尚未得到充分理解.有研究顯示在nsPEFs 作用后,細胞形態會發生變化,表現為細胞腫脹、變圓、起泡、起皺、出現足小體等,這些可能是導致細胞骨架破壞的原因[107,108].Pakhomov 等[50]對比了4 個600 ns,19.2 kV/cm 的脈沖作用于不同電擊液環境下的中國倉鼠卵巢細胞CHO-K1,結果表明細胞骨架的變化與EP 導致的細胞腫脹有關.該研究使用等滲透壓蔗糖溶液抑制細胞在EP 后的腫脹,對比正常電擊液下存在細胞腫脹的情況,發現前者AT 解體受到抑制,表明細胞膜EP 導致的細胞膜內外滲透壓變化及細胞腫脹是細胞骨架完整性受到破壞的重要原因.這項研究說明nsPEFs 導致的細胞次級效應在nsPEFs 與細胞器相互作用中扮演了重要角色.

NsPEFs 對細胞骨架破壞的機制包括:直接破壞機制和由次級效應引起的細胞骨架破壞間接機制.直接機制包括nsPEFs 引起AT 和MT 等的構象變化,使細胞彈性降低,細胞膜通透性增加.對于參與細胞內運輸的MT 的直接破壞,會影響細胞內細胞器位置.如溶酶體的運動受抑制.細胞骨架破壞的間接機制存在多種情況:細胞骨架參與維持細胞形態,nsPEFs 作用后,細胞腫脹,體積增大,誘導細胞骨架破壞;鈣離子是調節AT 和MT的信號分子,nsPEFs 作用后的鈣離子濃度增加使MT 解聚,破壞細胞骨架;nsPEFs 作用后,細胞內離子濃度變化,為了恢復正常的胞內離子濃度會導致嚴重的ATP 耗竭,抑制相關蛋白的合成從而使細胞骨架破壞;此外,nsPEFs 引起的脂質信號分子PIP2 的耗竭和磷脂酶C (phospholipase C,PLC)活化也可能是導致細胞骨架破壞的間接機制之一.

3.2 細胞骨架相關亞細胞結構的變化

細胞骨架與細胞膜的連接決定了細胞形狀,與細胞間連接、細胞與基底間連接、溶酶體等相關.因此nsPEFs 不僅可以導致細胞骨架解聚,也可能影響與細胞骨架相關的其他亞細胞結構.Thompson等[41]在研究20 個600 ns,16.2 kV/cm 的脈沖對中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)的影響中,觀察到nsPEFs 作用完數秒鐘后細胞膜起泡,發生MT 解聚、鈣離子流入、溶酶體裂解等一系列細胞內變化.

細胞骨架的組成部分AT 和IFs 等可以跨膜建立起細胞-細胞、細胞-細胞外基質之間的連接,這種連接是維持細胞及組織機械穩定性和實現相鄰細胞間的信號傳遞和分子運輸等生化功能的重要結構[109].

緊密連接(tight junction,TJs)可以封閉細胞間縫隙,進而調控分子從頂端向基底面移動,維持組織內不同功能區域,緊密連接還與細胞骨架緊密相連.Shi 等[110-112]利用電阻抗譜結合免疫熒光染色等實驗方法觀察到不同個數和場強的100 ns脈沖電場對老鼠肝上皮細胞WB-F344 的緊密連接會產生影響,并且觀察到這種影響存在脈沖劑量關系.圖4 給出了緊密生長的單層細胞在nsPEFs 作用下通透性增加的3 個主要通道,即細胞膜穿孔、細胞間連接的破壞及細胞死亡后脫離導致的空隙.

圖4 NsPEFs 對貼壁細胞的影響.1,破壞細胞與細胞間連接;2,細胞膜電穿孔;3,細胞脫落Fig.4.Effect of nsPEFs on adherent cells.1,Disruption of the intercallular connections;2,electroporation;3,cell necrosis or shedding.

間隙連接(gap junctions,GJs)是細胞間膜上六簇連接蛋白組成的供親水性小分子直接通過的通道,存在于大多數正常細胞中,負責細胞間直接通信,與細胞的增殖、分化和凋亡等相關[113].Steuer等對大鼠肝上皮細胞施加20 個20 kV/cm,100 ns脈沖電場,發現nsPEFs 除了會導致細胞骨架解聚,還觀察到細胞膜上的連接蛋白堆積,減少了與膜結合的連接蛋白,從而干擾了間隙連接細胞間直接通信[52].此外,對單層細胞施加不同場強(10,15,20 kV/cm)、不同脈沖數的脈沖電場,結果表明nsPEFs 對GJs 的影響是一個劑量和場強相關的過程.如表1 所列,脈寬從10 ns 到600 ns,場強在10 kV/cm 量級的脈沖電場都能對細胞骨架及相關亞細胞結構產生影響.

細胞骨架及其相關聯的細胞連接也是導致nsPEFs 對懸浮細胞和貼壁細胞不同影響程度的主要因素.Stacey 等[98]對4 種不同細胞進行了不同參數的nsPEFs 處理,發現懸浮液中細胞活力大幅下降而貼壁細胞存活率下降相對較小.

4 內質網和線粒體相關變化

4.1 NsPEFs 引起的內質網膜電穿孔及相關效應

鈣離子是細胞內的第二信使,對于機體的各項生理活動不可缺少,它可以維持細胞膜兩側的電位差,參與細胞內的信號傳導,對細胞內蛋白質調控、細胞凋亡等都起到重要的作用.鈣離子廣泛分布于內質網和線粒體內,尤其內質網被稱為細胞內的鈣庫[114,115].胞內鈣離子增加的途徑主要是以下兩個:一是胞內釋放,即內質網等儲存鈣離子的細胞器釋放鈣離子到細胞質中,因此內質網膜穿孔可以顯著提高胞內鈣離子水平;二是胞外流入,即細胞外微環境中的鈣離子通過細胞膜上的離子通道或者是EP 后形成的“納米孔”進入細胞內[99].

Tolstykh 等[116]研究發現nsPEFs 能夠導致內質網膜穿孔,導致鈣離子釋放到細胞質中,從而增加細胞內鈣離子的濃度.Beebe 等[75]探索了10—300 ns 范圍的脈沖電場對人類白血病細胞(HL-60)的結構和功能的影響.他們發現在不引起細胞膜EP 的PEFs 作用下,細胞內鈣離子水平提高,表明nsPEFs 可以直接作用于內質網使其釋放鈣離子.

內質網在細胞內負責合成或折疊蛋白質,這項功能受外界刺激而發生變化的現象叫做內質網應激.內質網應激過強或者持續時間過久會導致細胞凋亡,與糖尿病、肥胖癥等有關[117].而應激反應是生物體避免外界刺激出現的防衛措施.德島大學Oyadomari 課題組[40,81,83]發現nsPEFs 會激活內質網應激反應,可能與內質網膜穿孔相關.Furumoto 等[83]對Hela 細胞和鼠類胚胎成纖維細胞(MEF)施加14 ns,80,100 kV/cm;70 ns,20,30,50 kV/cm 兩種脈寬的脈沖電場,發現內質網膜穿孔及胞內鈣離子釋放.另外,nsPEFs 直接誘導真核起始因子(eukaryotic initiation factor-2α,eIF2α)磷酸化,顯示nsPEFs 激活了內質網應激反應,并且70 ns 脈沖引起的應激反應強度較14 ns 強.這項研究表明攜帶有更高頻率信息的短脈沖對內質網作用更加明顯.

NsPEFs 導致的內質網應激可進一步誘導腫瘤細胞凋亡[118].Rossi 等[39]利用200 ns,7 kV/cm的脈沖電場處理小鼠黑色素瘤細胞(B16-F10)和淋巴瘤細胞(EL-4),發現nsPEFs 引起內質網應激,并伴有免疫原性細胞死亡.這些研究表明脈寬、電場強度是控制nsPEFs 引起應激現象及連鎖反應的重要因素.

4.2 nsPEFs 引起的線粒體膜穿孔及相關效應

圖5 給出了nsPEFs 誘導細胞凋亡的一種主要途徑.線粒體包含觸發細胞凋亡的關鍵調節因子,是誘導腫瘤細胞凋亡的主要靶標[68].細胞凋亡是指細胞為維持內環境穩定,由基因控制的細胞自主有序的死亡,是細胞的主動死亡過程.在凋亡信號觸發后,一些凋亡因子,如細胞色素C 從線粒體釋放進入細胞質中,然后激活細胞凋亡蛋白酶caspase,誘導細胞凋亡.線粒體凋亡途徑中的很多關鍵事件,包括線粒體信號傳導途徑的啟動和完成,都是由細胞中鈣離子信號觸發的.因此鈣離子不僅可以影響線粒體膜的通透性,還可以通過觸發細胞色素C 的進一步釋放來放大凋亡信號[98,119].

圖5 NsPEFs 誘導的細胞內凋亡途徑Fig.5.Apoptosis pathways for cells after exposure to nsPEFs.

研究發現,nsPEFs 可引起線粒體膜電位耗散、線粒體腫脹等變化[70,120,121].線粒體膜電位的耗散與細胞活力喪失之間存在密切的關系,并且與細胞質中鈣離子相關.Guerrero-Hernandez 等[36]對肝癌細胞施加場強最高達80 kV/cm,脈寬600 ns,上升下降沿時間分別為15 和150 ns 的多種強度脈沖電場.發現nsPEFs 作用后的肝癌細胞產生明顯的線粒體膜電位耗散.其中nsPEFs 的上下沿,即高頻成分,發揮了主要作用.nsPEFs 使線粒體電穿孔同內質網一樣也會導致胞內鈣離子釋放,并且往往伴隨著caspase 蛋白酶激活,細胞活力喪失.熊本大學的Morotomi-Yano 等[65]對HeLa S3 細胞施加80 ns,20 kV/cm,1 Hz 的電脈沖,結果顯示nsPEFs 誘導釋放的鈣離子參與了細胞內信號傳導,并且這些信號傳導事件與細胞死亡和存活的調節相關.Muratori 等[96]對HEK 293 細胞施加了300 ns,25.5 kV/cm 的脈沖電場,發現nsPEFs激活了TMEM16F 蛋白酶(或Anoctamin 6),其中TMEM16F 蛋白酶與鈣離子和細胞凋亡有關.如表1 所列,通過改變nsPEFs 參數,可以針對不同細胞調控其胞內鈣離子濃度從而調節細胞功能,如細胞凋亡[122,123].Nuccitelli 等[71]和Guo 等[72]報道免疫原性細胞死亡的特征是釋放危險相關分子模式(danger-associated molecular patterns,DAMPs),ATP 是其中一種關鍵性DAMPs.ATP 耗竭會迅速導致細胞壞死,研究表明nsPEFs 處理后,細胞內ATP 被消耗.nsPEFs 還會引起細胞內的ROS增加,眾多研究發現,nsPEFs 引起胞內ROS 水平顯著增加,產生的ROS 可能導致細胞刺激和氧化性細胞損傷,并通過凋亡、壞死或焦亡等信號通路導致細胞死亡[60,94,124,125].

5 細胞核相關變化

細胞核是細胞遺傳與代謝的調控中心,nsPEFs引起的細胞核變化是多樣的[126].Zhuang 等[127]利用單細胞介電殼層模型對比100 ns 和100 μs 脈沖電場對Jurkat 細胞膜、細胞質、細胞核等亞細胞結構的介電變化,發現nsPEFs 除了與μsPEFs 一樣導致細胞膜EP,還會導致細胞核膜電導率增加,表明nsPEFs 可以導致細胞核膜電穿孔.Chen 等[89]采用實時熒光標記成像方法研究10 ns,65 kV/cm和60 ns,25 kV/cm 兩種脈寬、能量相同的脈沖電場對HL-60 細胞核的影響,結果表明nsPEFs 可以導致細胞核電穿孔并影響核質.Chen 等[92]在2007年報道了60 ns,60 kV/cm 的脈沖電場會損傷Jurkat 細胞和HL-60 細胞的DNA.他們發現對核膜進行充電會導致核膜中形成納米孔,并且nsPEFs會通過抑制snRNA 的生成改變亞核結構.此研究首次表明nsPEFs 改變了核蛋白復合物.Chen 等[18]對黑色素瘤細胞(B16-F10)施加100 個300 ns,40 kV/cm 的電脈沖后,發現nsPEFs 誘導DNA 雙鏈斷裂,降低了血管內皮生長因子(VEGF)和血小板衍生的內皮細胞生長因子(PD-ECGF)蛋白的表達,促進了細胞凋亡.

nsPEFs 引起的細胞核變化包括:1) nsPEFs可以導致核膜的電穿孔[97];2) nsPEFs 可以影響核RNA-蛋白質復合物及核斑點的變化[92],主要表現為核內亞結構數量和大小的變化.核RNA-蛋白質復合物的變化反映了細胞轉錄機制的破壞.此外,由于DNA 是帶電物質因此易受電場的影響,nsPEFs 可以直接誘導DNA 損傷從而使細胞死亡.另一方面,核被膜的穿孔也可以促進DNA 質粒進入核內,增強細胞的基因表達[75].

6 其他亞細胞結構

除了上述提到的細胞器生物電效應,nsPEFs影響溶酶體的運動,使溶酶體去膜化、損傷溶酶體等[128].溶酶體可以降解損傷的細胞膜和細胞器,參與細胞自噬過程.2014 年,Thompson 等[41]發現了溶酶體、鈣離子和細胞骨架三者之間存在聯系,研究發現在含鈣離子的培養基中生長的細胞在施加高閾值劑量的nsPEFs 后,MT 破壞,溶酶體遷移停止.2018 年,Thompson 等[42]為了探究細胞內鈣離子濃度是如何影響溶酶體運動,對中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)施加了600 ns,16.2 kV/cm的納秒脈沖電場,研究發現在含鈣離子的溶液中,施加nsPEFs 會破壞細胞骨架結構,從而阻止溶酶體運動.他們分別拍攝了高鈣離子濃度的溶液和不含鈣離子的溶液中溶酶體運動圖像,發現溶酶體運動情況也受細胞內鈣離子濃度影響.高鈣離子濃度的溶液中,細胞內溶酶體遷移停止,而在缺乏鈣離子溶液中,一些溶酶體發生移位.Kielbik 等[129]研究發現鈣離子與細胞骨架破壞之間存在相關性,通過共聚焦顯微鏡觀察,鈣離子濃度增加所引起細胞骨架破壞程度更加顯著,這與Thompson 等的研究一致.由于細胞骨架受到破壞,因此受細胞骨架牽引的溶酶體運動受到抑制.

NsPEFs 作用下,囊泡的脂質雙分子層形成瞬時孔隙,囊泡膜的通透性增加[130].Qian 等[131]在研究nsPEFs 介導的抗腫瘤免疫反應機制時發現,nsPEFs 誘導了細胞外囊泡的釋放.

細胞各亞結構相互聯系緊密,因此nsPEFs 與細胞的相互作用往往會存在多種細胞器的物理結構和生化功能的變化,及其他次級效應.除了上述主要的細胞器結構及相關的細胞間連接、溶酶體、囊泡等,有文章報道nsPEFs 對細胞內的酶也會產生影響[132].Della Valle 等[133]通過分子動力學仿真100 ns 脈沖電場對超氧化物歧化酶結構的影響,表明103kV/cm 以上的nsPEFs 可以直接影響酶活性部位的靜電場,從而導致酶結構發生變化.Guo 等[134]測量了電場5—30 kV/cm,100 和300 ns脈沖電場作用于小鼠口腔癌后,口腔癌細胞內NOS的變化,預示一氧化氮合成酶可能受到影響.

7 結論

本文基于nsPEFs 的細胞器生物電效應的研究發展簡史及不同細胞器結構和功能變化等展開敘述,總結了2000 年以來nsPEFs 的細胞器生物電效應相關文獻,尤其是近五年的研究.通過表1所列的總結數據可以看出,對于施加同一種脈沖參數,不同細胞類型在nsPEFs 處理后的細胞器生物電效應存在顯著差異.對于同一種細胞,僅僅改變nsPEFs 參數的其中一項指標,比如脈寬、電場強度、脈沖個數、脈沖極性等,細胞器效應的表現也會產生明顯變化.因此在研究nsPEFs 的細胞器效應時,需要結合特定的脈沖參數及細胞類型進行討論.根據現有的研究綜述,作者提出若干未來研究中值得加強關切的問題:

1) 已有的研究多聚焦于nsPEFs 對懸浮細胞的細胞器生物電效應,懸浮狀態下的細胞以單一個體的形式存在,而實際應用往往在組織層面進行,未來的研究應更多考慮在多細胞體系或生物組織中發揮重要作用的細胞間連接,細胞與外基質間連接的影響.

2) 傳統的基于熒光等標記物的觀察手段,以及掃描電子顯微鏡等都會對被測物產生不可逆傷害,而且往往難以觀察到脈沖電場生物電效應的快速響應.一些物理技術,比如生物介電譜方法,具有非侵入性、實時、原位觀測的優勢,因此可以用生物介電譜技術研究nsPEFs 的細胞器生物電效應.

3) 超分辨光學顯微成像技術除了具有非侵入性、實時原位觀察的優勢,還具有較高的空間分辨率,可達幾十納米.超分辨成像可以為進一步深入理解nsPEFs 的細胞器生物電效應及相應機理提供更多新信息,促進nsPEFs 技術在生物醫學領域的進一步發展與應用.

4) 大量研究表明nsPEFs 可以抑制腫瘤生長和誘導抗腫瘤免疫反應,nsPEFs 誘導癌細胞凋亡涉及的靶點較多,且基本都與細胞器相關.因此,加強nsPEFs 的細胞器生物電效應的研究有助于發現癌細胞凋亡靶點,開發新的腫瘤免疫療法.

5) 近年的研究和臨床試驗表明,μsPEFs 可作為一種新型物理能量用于心肌組織消融,治療房顫等心臟疾病.相比μsPEFs,nsPEFs 引起的肌肉收縮更弱、氣泡更少、消融更均勻,有望成為更好的脈沖電場心肌消融技術.此外,房顫發生與心肌細胞間連接等細胞器緊密相關,未來可加強nsPEFs對心肌細胞及其細胞器的相關研究.

現有診斷技術的局限和人們對細胞和組織等生物體系本身理解的不足,使得nsPEFs 的生物電效應尚未得到充分理解,本文聚焦nsPEFs 的細胞器生物電效應,旨在為nsPEFs 腫瘤治療、軟組織消融等生物醫學領域的研究和應用提供參考.