基于宏基因組學技術的八種中日酒曲微生物多樣性對比分析

唐鰻秋,夏玙,吳正云,周山大慶,張文學,3*

1(四川大學 輕工科學與工程學院,四川 成都,610065)2(明石工業高等專門學校 電氣情報工學科,日本 兵庫縣,674-8501)3(四川大學錦江學院 白酒學院,四川 眉山,620860)

清香型小曲酒又稱“川法小曲酒”,是用高粱、玉米等糧谷類原料,以清香型小曲作糖化發酵劑釀制的白酒，具有風格獨特,清香怡人的特點[1]。邛崍米曲是我國小曲中的著名曲種之一,傳統邛崍米曲中添加了72味中藥成分,使所釀小曲酒極具特色風味。黃酒是我國歷史悠久的傳統發酵酒,與啤酒和葡萄酒并稱為世界3大發酵酒,其風味獨特、營養豐富,酒精含量8%～15%[2]。

日本酒主要有日本清酒(sake)、燒酒(shochu)、泡盛(awamori)3大類。日本清酒是借鑒中國黃酒的釀造法而發展起來的日本國酒,也是一種發酵酒[3],酒精含量大于15%,富含多種氨基酸和維生素。日本燒酒是一種蒸餾酒,酒精含量通常為25%,典型代表為本格燒酒[4]。米燒酒、紅薯燒酒、黑糖燒酒通常采用米曲,麥燒酒一般用麥曲。日本泡盛酒是日本最古老的蒸餾酒,被稱為日本燒酒的始祖,盛產于沖繩,酒精含量30%～45%,其釀造方法獨特[5],是將精選泰國米制成米麴,將米麴和水一次性下料進行發酵,再蒸餾而成。

“曲乃酒之骨”,酒曲中的微生物決定酒曲品質。TANG等[6]利用高通量測序技術分析了小曲中微生物多樣性,結果顯示葡萄球菌屬(Staphylococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、根霉屬(Rhizopus)和假絲酵母屬(Candida)為優勢菌屬。唐潔[7]利用變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)技術分析了清香型小曲微生物群落結構,結果發現小曲中主要的細菌菌屬為乳酸菌屬、芽胞菌屬和葡萄菌屬,主要酵母為扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera),主要霉菌有米根霉(Rhizopusoryzae)和土曲霉(Aspergillusterreus)。目前有關國內曲酒的研究已有很多,但鮮有與日本酒曲的對比研究,而且國內酒曲研究較多集中于大曲[8-10]。本研究選取的8種酒曲具有中日酒曲的典型代表性,且均制曲發酵周期較短,類似于中國小曲類酒曲,因此很有必要對其進行一個全面的對比研究。

宏基因組學技術[11]是針對樣品中全部微生物的總DNA,從基因組文庫中篩選功能基因或直接進行高通量測序,來分析微生物多樣性并挖掘功能基因。近年來,宏基因組測序已廣泛應用于泡菜、奶酪、香醋、酒、發酵香腸等發酵食品的功能微生物研究[11-12]。本研究采用宏基因組學技術對8種酒曲中微生物群落結構進行研究,旨在解析中日酒曲微生物種群結構的差異,同時對8種酒曲進行了基因功能預測,為后續篩選特定功能微生物,并進行功能強化曲制作工藝優化,開發出功能型強化酒曲提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒曲樣品：邛崍米曲MB,四川省邛崍市某酒廠制曲車間；清香型小曲QX,四川省瀘州市某酒廠制曲車間；黃酒麥曲FHC,四川省南充市某黃酒廠制曲車間；黃酒麥曲TH,浙江省紹興市某黃酒廠制曲車間；日本清酒米曲NP_MS、日本燒酒米曲NP_SJR、日本燒酒麥曲NP_SJW、日本泡盛酒曲NP_SY,均由日本合作高校采集并郵寄。

主要試劑：NaOH、無水乙酸鈉、冰乙酸、KI、可溶性淀粉、CuSO4·5H2O、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、甲醛溶液(37%～40%),均為分析純,成都科龍化工試劑廠；E.Z.N.A.Soil DNA Kit,美國Omega公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C酸度計,上海儀電科學儀器股份有限公司；DYY-5瓊脂糖凝膠電泳儀,北京六一儀器廠；Legend Micro 17R高速冷凍離心機,美國賽默飛公司；GeneAmp?9700型PCR儀,美國ABI公司；Illumina Hiseq PE150高通量測序平臺,美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 中日酒曲制曲工藝

中國酒曲：邛崍米曲是以大米為原料,經浸泡、碾碎、加入曲母和72味中草藥拌曲、制胚、進箱培菌、出箱烘干等流程,經約90 h發酵而成的餅曲；清香型小曲是以麩皮、米糠和米粉為原料,經碾細、加入種曲拌和、踩曲、切曲、生火入房、保溫、通氣、關燒、烘曲等流程,經約90 h發酵而成的散曲；黃酒麥曲是以小麥為原料,經過軋碎、拌水、踩曲、壓制成型、入房堆積等流程,經7 d左右發酵而成的塊曲。

日本酒曲：清酒米曲[13]是以日本米為原料,經浸米、蒸米、干燥、冷卻、入室堆置、加入種曲揉碎、搓拌翻轉、重疊堆置、調換曲盤位置、出室放冷等流程,經約46 h發酵而成的散曲；燒酒曲是以日本米或小麥為原料,經浸泡、蒸煮、冷卻、配種、恒溫恒濕堆積培養、攤開混勻、再堆積、翻曲、干燥等流程,經約40 h發酵而成的散曲；泡盛酒曲是以泰國長粒米為原料,經浸泡、蒸米、配種、40 ℃恒溫培養、干燥等流程,經約40 h發酵而成的散曲。

1.3.2 理化指標檢測

參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[14]測定樣品中水分、糖化力、液化力、發酵力和酸度。還原糖測定采用標準葡萄糖液反滴定的還原糖測定法[15]。

1.3.3 DNA提取及測序

采用試劑盒提取酒曲微生物宏基因組DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA完整性,用NanoDrop2000檢測純度,用Quantus Fluorometer(Picogreen)檢測濃度。建立宏基因組測序文庫,送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序,測序平臺為Illumina Hiseq PE150。

1.3.4 測序數據分析

對原始數據進行質控預處理,得到有效序列[16],用于后續分析。使用BLASTP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將非冗余基因集分別與NR數據庫和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)基因數據庫(GENES)進行比對[17],然后通過NR庫對應的分類學信息數據庫獲得物種注釋結果,再使用物種對應的基因豐度總和計算該物種的豐度,獲取各樣本分別在門、屬和種水平上的分類情況；根據與GENES的比對結果使用KOBAS 2.0(KEGG orthology based annotation system)進行功能注釋[18]。用R語言的Vegan軟件包進行典型對應分析(canonical correspondence analysis,CCA)并繪圖。使用KO、Pathway、EC、Module對應的基因豐度總和計算該功能類別的豐度。使用Origin 2018軟件對8種酒曲樣品的優勢微生物進行柱狀圖的繪制。

2 結果與討論

2.1 八種中日酒曲理化指標對比

8種中日酒曲的各理化指標情況見表1。酒曲水分含量越低,即其發酵產生的游離水越多,在一定程度上反映出酒曲發酵的成熟度越好[19]。8種酒曲的水分含量依次為FHC>NP_SJW>NP_SY>TH>MB>NP_MS> NP_SJR>QX。還原糖由糖化酶酶解淀粉生成,FHC還原糖含量最低,NP_SJW最高。酒曲的酸度主要是由產酸微生物進行有機酸代謝產生的。8種酒曲的酸度由高到低為：NP_SY>FHC>MB>NP_MS>NP_SJW> NP_SJR=QX>TH,說明NP_SY內部微生物產酸代謝相對旺盛。糖化力和液化力往往呈正相關,且酒曲的糖化力和液化力越高,其原料利用率和出酒率就越高。NP_SJW、NP_SJR和NP_MS的糖化力和液化力最高,NP_SY和QX的糖化力最低,TH和NP_SY的液化力最低。發酵力是反映酒曲產酒能力的重要指標。酒曲的產酒能力是固態白酒發酵、生酯產香的基礎。MB和QX的發酵力最高,均大于1.40 U,NP_SJR的發酵力最低,僅為0.04 U?？傮w來看,日本酒曲的平均糖化力、液化力和還原糖含量均略高于中國酒曲,中國酒曲的平均發酵力略高于日本酒曲。

表1 八種中日酒曲理化指標

2.2 八種中日酒曲宏基因組測序結果

經Illumina平臺測序后從8個樣品中共得到50 155 557 812 bp的原始堿基數；在原始測序數據中存在著部分低質量數據,為提高后續分析結果的準確可靠,需對原始測序數據進行質控預處理。具體測序及質控結果情況如表2。

表2 原始數據及質控結果

2.3 八種中日酒曲的微生物群落結構分析

由圖1-a可知,在門水平上,MB和QX主要為子囊菌門(Ascomycota,分別為9.29%、8.86%)、厚壁菌門(Firmicutes,分別為3.27%、5.21%)和變形菌門(Proteobacteria,分別為0.22%、1.59%)。TH主要為放線菌門(Actinobacteria,82.66%)、厚壁菌門(2.57%)、擔子菌門(Basidiomycota,2.51%)和變形菌門(1.58%)。FHC主要為變形菌門(35.17%)、厚壁菌門(23.58%)、子囊菌門(7.46%)和擔子菌門(2.48%)。日本酒曲均主要為子囊菌門(均>93%),NP_SJR和NP_SJW還有少量厚壁菌門(分別為6.38%、0.89%)。

由圖1-b可知,在屬水平上,MB和QX主要為根霉屬(分別為81.39%、78.70%)。TH主要為糖多孢菌屬(Saccharopolyspora,59.70%)。陳青柳[12]研究發現,糖多孢菌屬(54.77%)是紹興黃酒麥曲和發酵中特有的優勢菌屬,與本研究結果一致,其在黃酒發酵過程中的具體作用值得進一步研究。FHC物種組成相對最為豐富,主要有橫梗霉屬(Lichtheimia,25.02%)、葡萄球菌屬(11.33%)、腸桿菌屬(Enterobacter,9.51%)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella,9.37%)和曲霉屬(Aspergillus,7.14%)。4種日本酒曲均主要為曲霉屬(均>91%),NP_SJR還有少量葡萄球菌屬(6.30%)。這與“日本酒神”坂口謹一郎[20]指出的中國為中心的東亞大陸到東南亞的曲的主要菌為根霉屬和毛霉屬(Mucor),日本酒曲的主要菌為曲霉屬一致。由于曲霉屬等絲狀真菌有利于糖化酶的產生,因此日本酒曲的糖化力總體高于中國酒曲(表1),與徐巖等[21]的研究結果一致。

由圖1-c可知,在種水平上,MB和QX主要有戴爾根霉(Rhizopusdelemar,分別為67.11%、65.18%)和小孢根霉(Rhizopusmicrospores,分別為12.11%、11.82%)。TH主要有刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa,30.49%)、糖多孢紅霉菌(Saccharopolysporaerythraea,14.62%)和糖多孢菌(Saccharopolysporarectivirgula,14.52%)；FHC主要有橫梗霉(Lichtheimiaramosa,20.80%)、Klebsiellacf.planticolaB43(6.19%)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae,5.94%)和木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosust,5.85%)。NP_MS、NP_SJR和NP_SJW的物種組成類似且較單一,均主要為米曲霉(均>50%)、黃曲霉(均>36%)、Aspergillusnomius(分別為1.87%、1.74%、1.86%)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus,分別為1.84%、1.73%、1.86%)。NP_SY主要為白曲霉(Aspergilluskawachii,44.63%)、琉球曲霉(Aspergillusluchuensis,31.55%)、黑曲霉(Aspergillusniger,18.04%)和米曲霉(1.74%)。這些霉菌能分泌豐富的多糖水解酶,被認為是酒曲中重要的糖化微生物[22]。日本酒曲中用于將淀粉原料分解為糖的曲霉主要為黃曲霉、白曲霉和黑曲霉。日本清酒米曲和燒酒酒曲中主要為不產檸檬酸的黃曲霉,而泡盛酒曲則主要為產檸檬酸的白曲霉和黑曲霉,用含酸量高的酒曲制出的酒醪因其他雜菌難以繁殖,具有不易腐敗的特點[23]。

a-門水平；b-屬水平；c-種水平

2.4 八種中日酒曲微生物群落與理化因子的關聯分析

典型關聯分析(canonical correlation analysis,CCA)[22]是最常用的挖掘數據關聯關系的算法之一。選擇8種中日酒曲樣品中相對豐度前10位的菌屬與水分、糖化力、液化力、發酵力、還原糖和酸度等理化因子進行CCA。由圖2可知,TH和FHC呈正相關,QX和MB呈正相關,4種日本酒曲呈正相關。糖化力與液化力、酸度、還原糖和水分均呈正相關,與發酵力呈負相關,其中發酵力、液化力和還原糖對物種的影響程度最大,酸度影響程度最小。曲霉屬與水分、糖化力、液化力、酸度和還原糖呈正相關,與發酵力呈負相關。4種日本酒曲與曲霉屬和葡萄球菌屬呈正相關,TH和FHC與糖多孢菌屬、腸桿菌屬、橫梗霉屬、克雷伯氏菌屬呈正相關,QX和MB與魏斯氏菌屬、寄生霉菌屬(Parasitella)、木霉屬、畢赤酵母屬、根霉屬、酵母屬和威克漢姆酵母屬呈正相關。由此說明,中日酒曲中微生物的種群結構對其理化指標具有顯著影響。

圖2 八種中日酒曲微生物群落和理化因子的CCA分析

2.5 八種中日酒曲KEGG功能注釋及差異分析

如圖3所示,在KEGG一級代謝中共發現微生物代謝功能6類：代謝、人類疾病、生物體系統、遺傳信息處理、環境信息處理和細胞過程。8種中日酒曲均以代謝為絕對優勢功能(均>27%),說明酒曲內部微生物代謝活動均較為活躍,為各自風味的形成提供了物質基礎。

圖3 八種中日酒曲基因表達的KEGG一級代謝功能分析

對代謝子功能進行具體分析和差異分析,如圖4,共注釋到12種代謝功能,由其豐度可知,8種中日酒曲中碳水化合物和氨基酸均存在較為旺盛的代謝特征。氨基酸決定了酒的風味,在酒的香型及口感形成中起著重要作用[24]。日本酒曲的氨基酸代謝和脂質代謝的相關基因表達量均高于中國酒曲,這可能是由于日本酒曲中主要為絲狀真菌曲霉屬,其具有較強的產糖化酶和蛋白酶能力。8種中日酒曲之間具有顯著性差異的代謝功能有6個,分別為碳水化合物代謝、代謝通路總覽、外源性生物降解和代謝、其他氨基酸代謝、其他次生代謝產物的生物合成、萜類和聚酮類代謝,其中中國酒曲的碳水化合物代謝、代謝通路總覽、萜類和聚酮類代謝的相關基因表達量均高于日本酒曲,推測可能與中國酒曲中主要存在的根霉屬、糖多孢菌屬和橫梗霉屬有關。

圖4 八種中日酒曲代謝途徑的基因表達KEGG二級代謝功能差異分析

3 結論

本研究以8種中日典型酒曲為研究對象,通過宏基因組技術探究了中日酒曲的微生物多樣性。總體而言,中日酒曲之間具有較顯著差異的有曲霉屬、根霉屬、糖多孢菌屬和橫梗霉屬,日本酒曲以曲霉屬為主,中國酒曲以根霉屬、糖多孢菌屬和橫梗霉屬為主。同時對8種酒曲的理化特性進行了對比分析,其中日本酒曲的平均糖化力、液化力和還原糖含量均略高于中國酒曲,而中國酒曲的平均發酵力略高于日本酒曲。由CCA可知,8種中日酒曲中微生物的種群結構與其理化指標存在明顯關聯,且發酵力、液化力和還原糖含量與微生物物種分布相關程度最大。此外,對中日酒曲進行了KEGG功能注釋,中日酒曲中微生物均主要參與代謝功能,集中在碳水化合物代謝、氨基酸代謝和代謝通路總覽,其中中日酒曲之間具有顯著性差異的有碳水化合物代謝、代謝通路總覽。本文探究了中日酒曲中微生物群落及理化特性的對比差異及相互關系,有助于利用全基因組測序解析中日酒曲與各類風味物質形成相關功能微生物,后續可通過分析功能微生物具體代謝途徑和機理來研究其對酒曲及酒的風味和品質的作用,進一步篩選特定功能微生物,開發出功能型強化酒曲,并將功能型強化酒曲應用于幾類中國酒的試生產過程中,以期為我國釀酒工業化發展提供研究基礎。