雙酶協同降解膠體幾丁質及其作用機制

吳 昊，劉嘉荔，楊靜文，胡雪芹，張洪斌

（合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009）

N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc），化學式為C8H15NO6，是一種重要的多功能單糖，在生物體內作為多糖透明質酸、肝素、硫酸角質素的重要組成部分之一，維持生物體正常的生理功能[1]。在生物醫藥領域，GlcNAc治療風濕性關節炎具有顯著功效[2]；而在食品行業中，它不僅能用于食品抗氧化劑及嬰兒食品添加劑，還是糖尿病患者的甜味劑及膳食補充劑等[3-5]，具有保護骨關節及軟骨組織的作用[6-8]。GlcNAc在食品等行業的多功能性使其年需求量激增，在市場上具有廣闊的應用前景。

甲殼素（幾丁質）作為全世界第2大天然多糖[9]，主要是由β-1,4-糖苷鍵連接的GlcNAc組成，廣泛存在于自然界包括甲殼類動物、脊椎動物、植物和微生物中[10]。有數據統計，全球每年會生產約600～800萬 t螃蟹、蝦和龍蝦殼廢物，而蝦蟹的外殼中幾丁質高達14%～27%[11-12]。如果能有效利用這些廢棄的幾丁質資源，不僅能解決環境污染問題，還可以帶來經濟效益。目前，工業上從廢棄蝦蟹殼中獲得GlcNAc的方法還停留在傳統的酸（堿）解法，這種生產方法存在著許多缺點[13-14]。例如酸（堿）廢液處理困難、安全隱患、效率低等[15]。近幾年來，更加安全且高效的酶解法逐漸成為研究熱點。Bao Jingjing等[16]介紹了一種由生物膜介導的多酶自組裝級聯系統（multienzyme-assembly-cascade，MAC）用于幾丁質降解制備氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN），該MAC系統顯示出色的催化活性、良好的溫度和pH值穩定性，可以將（79.02±3.61）%的幾丁質轉化為GlcN。Lv Chenyin等[17]將商用幾丁質酶（chitinase，ChiA）SgCtn與來自苜蓿鏈霉菌的β-N-乙酰基己糖胺酶SgHEX協同作用降解1%膠體幾丁質，可以在6 h內實現93.7%的GlcNAc收率。酶解法制備GlcNAc具有反應條件溫和、環境友好、產率高、產物易于獲得且分子質量均一等優勢[18-20]。研究發現，自然界有很多微生物都能產生水解幾丁質的酶[21-23]。目前為止，已發現有近40多種能夠水解幾丁質的酶，分別來源于細菌、真菌、放線菌等[24-27]，其分離純化所得的酶都表現出很高的生物活性[28-30]。

本研究建立一種雙酶協同催化體系，由ChiA和β-N-乙酰基己糖胺酶HJ5N組成。在最適反應條件下，該雙酶協同催化體系可以實現一步反應高效降解膠體幾丁質制備GlcNAc，具有反應條件溫和、效率高、產物單一、副產物少等優點。旨在為酶法制備乙酰氨基葡萄糖的工業應用提供一種有效策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BL21（DE3）/pET-22b（＋）-ChiA保存于實驗室；HJ5N基因來自于微小桿菌（Microbacteriumsp.），pET-28a（＋）-HJ5N質粒由實驗室構建并保存。質粒提取試劑盒、用于表達的宿主菌大腸桿菌 BL21（DE3）均購自北京全式金生物技術有限公司。

蝦殼幾丁質 生工生物工程（上海）股份有限公司；GlcNAc標準品 上海泰坦科技股份有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統（配有可變波長紫外檢測器和CSchrom plus色譜工作站） 美國科學儀器公司；XAmide色譜柱大連華譜科儀科技有限公司；VIS-723紫外分光光度計安徽中測儀器有限公司；ACQUITY UPLC Premier XE液相色譜-飛行時間質譜儀（配有電噴霧電離源） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養及粗酶生產

將ChiA的表達菌菌株BL21（DE3）/pET-22b-ChiA按1%（V/V）的接種量接到含氨芐青霉素的液體LB培養基中，于搖床250 r/min、37 ℃過夜培養；14～16 h后取適量活化好的種子培養液轉接至新的液體LB培養基富集培養；在培養至菌液濃度OD600nm為2.0～3.0時加入適量異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）并于25 ℃誘導培養6 h；誘導結束后4 ℃、8 000 r/min離心得到菌體沉淀；棄上清液后加入一定量K2HPO4/KH2PO4緩沖液；最后，振蕩、超聲破碎、離心即得ChiA粗酶液。

將HJ5N的表達菌菌株BL21（DE3）/pET28a-HJ5N按1%（V/V）的接種量接到含卡那霉素的液體LB培養基中，于搖床250 r/min、37 ℃過夜培養；14～16 h后取適量活化好的種子培養液轉接至新的液體LB培養基富集培養；在培養至菌體濃度OD600nm為2.0～3.0時加入適量IPTG并于25 ℃誘導培養11 h；誘導結束后4 ℃、8 000 r/min離心得到菌體沉淀；棄上清液后加入一定量的K2HPO4/KH2PO4緩沖液；最后，振蕩渦旋、超聲破碎、離心即得HJ5N粗酶液。

1.3.2 酶活力測定

ChiA活力測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法：取酶液200 μL，加1.8 mL的1%膠體幾丁質；在pH 6的K2HPO4/KH2PO4緩沖液中，50 ℃水浴反應1 h；然后取500 μL反應液加入到500 μL 3,5-二硝基水楊酸試劑中煮沸5 min，最終定容至5 mL，于紫外分光光度計540 nm波長處測OD值；空白對照為加滅活的酶液。ChiA活力定義：50 ℃單位體積下每分鐘產生1 μg乙酰氨基葡二糖時所用的酶量為1 U。

HJ5N活力測定采用對硝基苯酚比色法[31]：取酶液50 μL，加入450 μL終濃度為2 mmol/L的pNP-GlcNAc，在pH 6的K2HPO4/KH2PO4緩沖液中50 ℃水浴10 min，然后終止反應，加2 mL水，于405 nm波長處測OD值；空白對照為加滅活的酶液；通過測定生成的黃色對硝基苯酚含量計算生成的GlcNAc含量，以此計算酶活力。HJ5N活力定義：50 ℃單位體積下每分鐘產生1 μg GlcNAc所需要的酶量為1 U。

1.3.3 膠體幾丁質的制備

取適量粉碎后的蝦殼幾丁質，緩慢加入一定量的磷酸，于40 ℃攪拌溶解2～3 h，4 ℃靜置過夜；然后加入等體積50%乙醇溶液使膠體幾丁質完全析出；離心，棄上清液，測定pH值；最后重復用去離子水清洗膠體幾丁質直至pH 5.5～6；用緩沖液復溶即得不同質量濃度的膠體幾丁質溶液[32]。

1.3.4 酶法降解膠體幾丁質的產物分析

在一定質量濃度的膠體幾丁質溶液中，設置3 組實驗，分別加入ChiA（A組）、HJ5N（B組）、ChiA和HJ5N的混合粗酶液（C組）進行酶催化反應；3 組反應液經高溫滅活、離心、取上清液后，通過HPLC檢測產物。

1.3.5 產物的HPLC和質譜檢測

本研究所有樣品均通過HPLC檢測并結合外標法計算產物單糖和幾丁二糖濃度。

HPLC檢測條件：紫外檢測器，波長195 nm，流動相65%乙腈-35% KH2PO4溶液（KH2PO4溶液取0.7 g溶于1 L水），流速為1.0 mL/min，色譜柱為XAmide柱。

液相色譜-飛行時間質譜檢測條件：65%乙腈-35%水的等度條件，流速1.0 mL/min，XAmide柱，波長195 nm，檢測出產物的洗脫液引入質譜儀中，通過質量掃描識別進行分析。

1.3.6 底物殘留計算

底物殘留計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 雙酶協同降解膠體幾丁質催化體系的建立

本研究建立的雙酶協同催化體系主要包含ChiA和HJ5N。ChiA可以將多糖膠體幾丁質降解為幾丁二糖(GlcNAc)2，其最適溫度50 ℃、最適pH 6，在pH 5～9和50 ℃以下都可以穩定存在[27]。以此為基礎，從基因文庫中篩選得到了酶學性質與ChiA相近的HJ5N基因，并構建了重組工程菌BL21(DE3)/pET-28a-HJ5N，其誘導表達的HJ5N可以將幾丁二糖(GlcNAc)2進一步降解為單糖GlcNAc，且其最適反應溫度與pH值也為50 ℃和6.0。按1.3.4節方法對ChiA和HJ5N單獨或協同催化膠體幾丁質的產物進行HPLC分析，結果如圖1所示。

圖1 膠體幾丁質降解產物和GlcNAc標準品的HPLC檢測圖Fig. 1 HPLC chromatograms of GlcNAc standard and colloidal chitin hydrolysate

圖2 雙酶協同催化產物質譜圖Fig. 2 Mass spectra of the products of colloidal chitin hydrolysis catalyzed by ChiA and HJ5N

排除9～10 min為K2HPO4/KH2PO4緩沖液的吸收峰，圖1A在第13分鐘左右出現了單一吸收峰，為ChiA水解后的產物幾丁二糖(GlcNAc)2。圖1B證明HJ5N不會對膠體幾丁質產生水解作用，在液相譜圖中未發現有明顯的吸收峰。而從ChiA和HJ5N協同催化膠體幾丁質（圖1C）結果可以發現，第13分鐘的幾丁二糖吸收峰消失，在第15分鐘左右出現了新的產物峰，經過與標準品（圖1D）對比可初步確定為GlcNAc；通過質譜檢測進一步鑒定該產物（圖2），經分析可以確認M=GlcNAc，分子質量為221。質譜中主要產生m/z=261=221＋39＋1，為[M＋K＋H]＋（反應體系為磷酸鉀緩沖液，K為39），結合HPLC檢測結果可以確定雙酶協同降解膠體幾丁質的終產物為GlcNAc。這一結果證明了ChiA和HJ5N在對膠體幾丁質的水解過程中存在協同作用，ChiA將膠體幾丁質催化降解為幾丁二糖(GlcNAc)2，再由HJ5N進一步降解成GlcNAc（圖3）。

圖3 雙酶協同催化水解膠體幾丁質流程圖Fig. 3 Flow chart of enzymatic hydrolysis of colloidal chitin

2.2 雙酶協同反應機制

2.2.1 雙酶協同反應機制分析

為研究ChiA和HJ5N在對降解膠體幾丁質過程中的作用機制，以膠體幾丁質為底物，對ChiA和HJ5N在單獨或協同催化的效果進行了對比分析，結果如圖4所示。在相同反應條件下，ChiA單獨催化僅有30%底物在6 h內被降解，6 h后底物幾乎不會繼續下降，而ChiA和HJ5N協同催化12 h可以持續降解60%的膠體幾丁質，雙酶協同催化降解膠體幾丁質的效果遠高于ChiA單獨降解的效果。為了驗證ChiA是否變性失活，反應6 h在ChiA單獨催化的反應液中添加HJ5N，結果發現底物膠體幾丁質可以繼續被降解。在之前的實驗結果中可以確定HJ5N無法單獨降解膠體幾丁質，這表明ChiA可能只是被其產物(GlcNAc)2抑制了活性，而這種產物抑制現象也曾有相關文獻報道過[18,33]。HJ5N的加入可以快速將(GlcNAc)2轉化為GlcNAc，從而解除幾丁二糖對ChiA的抑制作用，恢復活性的ChiA則可以繼續降解膠體幾丁質，ChiA與HJ5N的協同催化可以實現對膠體幾丁質的持續降解。

圖4 不同反應條件下的底物含量隨時間變化圖Fig. 4 Percentage of residual substrate as a function of hydrolysis time under different hydrolysis modes

2.2.2 雙酶協同催化的產物分析

通過對雙酶協同催化反應不同反應時間的產物進行HPLC分析檢測，驗證產物抑制作用是否被消除。從圖5可以看出，整個催化過程中，并無ChiA的降解產物(GlcNAc)2產生，只有GlcNAc在持續增加，直至反應平衡。這證明了ChiA和HJ5N的協同催化不僅可以完全消除ChiA的產物抑制作用，加強對膠體幾丁質的降解，更可以實現一步反應制備GlcNAc無中間副產物生成。

圖5 ChiA和HJ5N協同催化產物質量濃度隨時間變化圖Fig. 5 Changes in concentrations of GlcNAc and (GlcNAc)2 during colloidal chitin hydrolysis co-catalyzed by ChiA and HJ5N

2.3 不同因素對雙酶協同催化體系的影響

2.3.1 溫度對雙酶協同催化體系的影響

為探究溫度對雙酶協同催化體系的影響，在pH 6，不同溫度（30、35、40、50 ℃）條件下，向40 g/L蝦殼幾丁質（膠體幾丁質11.4 g/L）中，各加入30 U/mL ChiA和HJ5N的粗酶液反應12 h，然后通過HPLC檢測產物質量濃度。如圖6所示，HJ5N活力受溫度影響較大，當溫度在40 ℃以上時，HJ5N穩定性較差，隨反應時間延長，HJ5N活力會持續下降直至失活，導致后續反應過程中只有ChiA在單獨催化降解膠體幾丁質，即(GlcNAc)2的質量濃度比GlcNAc高。而當溫度低于40℃時，HJ5N較為穩定，能與ChiA協同催化發揮作用，將膠體幾丁質持續水解為GlcNAc，反應液中也無(GlcNAc)2生成。因此雙酶協同催化體系的最適反應溫度為30 ℃。

圖6 溫度對雙酶協同催化體系的影響Fig. 6 Effect of reaction temperature on concentrations of GlcNAc and (GlcNAc)2

2.3.2 pH值對雙酶協同催化體系的影響

pH值也是影響雙酶協同催化效率的重要因素，在30 ℃和不同pH值（4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5）條件下，向100 g/L蝦殼幾丁質（膠體幾丁質35.8 g/L）中各加入30 U/mL ChiA和HJ5N的粗酶液進行反應12 h，定時取樣，通過HPLC檢測產物，結果如圖7所示。當pH值為6時，雙酶協同催化反應的GlcNAc質量濃度最高，當pH值小于5時，反應液中只有少量GlcNAc存在，說明此pH值下的ChiA、HJ5N很快變性失活。而當pH值大于6時，GlcNAc質量濃度也只有pH 6時的一半左右，證明了雙酶協同催化體系的最適反應pH值為6，此時ChiA和HJ5N可以發揮出最大的活性。

圖7 pH值對雙酶協同催化體系的影響Fig. 7 Effect of reaction pH on GlcNAc concentration

2.3.3 其余因素對雙酶協同催化體系的影響

研究在30 ℃和pH 6的最適反應條件下進行雙酶協同催化反應，并通過HPLC檢測產物濃度。探究底物質量濃度、雙酶添加比（加酶量（U）計）對雙酶協同催化體系的影響，結果如圖8所示。

圖8A為不同底物質量濃度（40、50、60、70、80、90、100 g/L）對雙酶催化體系的影響，其中ChiA和HJ5N各添加30 U/mL。催化反應所用底物來源為蝦殼幾丁質，其幾丁質含量并非100%。經過預處理除去蝦殼雜質后，剩余所得為膠體幾丁質干質量，經烘干、稱質量、繪制標準曲線（y=3.774x－3.455，x為底物質量濃度，y為膠體幾丁質質量濃度）后發現膠體幾丁質占比約33%，這與相關的文獻報道結論一致[25,34]。根據產物GlcNAc質量濃度與不同質量濃度膠體幾丁質對應的底物質量濃度比（即收率），探究底物質量濃度對雙酶催化體系的影響，如圖8A所示，當以40 g/L蝦殼幾丁質（膠體幾丁質11.4 g/L）為底物時，產物GlcNAc質量濃度為9.11 g/L，收率達80%。當蝦殼幾丁質濃度上升到90 g/L（膠體幾丁質30.3 g/L）時，GlcNAc質量濃度為17.55 g/L，收率為58%。繼續增加蝦殼幾丁質濃度到100 g/L（膠體幾丁質35.8 g/L），GlcNAc質量濃度反而下降到16.45 g/L，收率下降至46%。上述結果表明，雖然隨著底物質量濃度的上升，產物GlcNAc質量濃度也在升高，但是其收率卻在逐漸降低，證明即使雙酶協同催化可以消除產物抑制作用，但是由于底物膠體幾丁質為多糖，隨著其質量濃度升高，整個催化體系的黏度勢必會增加，進而影響ChiA和HJ5N的活力，導致雙酶協同催化體系對膠體幾丁質的降解效果降低，這也是收率下降的主要原因。

由圖8B可以看出，在固定ChiA添加量為30 U/mL的情況下，改變ChiA與HJ5N添加比對整個反應的影響較小，最終的GlcNAc質量濃度基本一致。因此按ChiA與HJ5N添加比為2∶1即保證雙酶協同催化體系對膠體幾丁質的降解效果。

2.3.4 雙酶分步催化與協同催化效率對比

研究在上述最優反應條件下，對ChiA與HJ5N分步催化（反應6 h在ChiA單獨催化的反應液中添加HJ5N）與協同催化效率進行對比分析，如圖9所示。結果表明，在不同底物質量濃度下，當ChiA與HJ5N分步催化時，由于產物抑制作用的存在，GlcNAc質量濃度較低，且增長緩慢。而當ChiA與HJ5N協同催化時，GlcNAc質量濃度會隨著底物質量濃度上升而增加，且遠高于分步催化的結果，證明了雙酶協同催化體系的有效性。

圖9 ChiA和HJ5N分步催化與協同催化產物質量濃度對比圖Fig. 9 Comparison of GlcNAc concentration as a function of substrate concentration between stepwise and one-step catalysis

3 結 論

本研究建立的ChiA和HJ5N協同催化體系可以實現一步反應高效降解膠體幾丁質制備GlcNAc。通過對ChiA和HJ5N的協同作用機制研究，發現ChiA會被其產物(GlcNAc)2抑制酶活力，雙酶協同作用可以有效解除這種產物抑制作用。在高含量膠體幾丁質下，雙酶協同催化降解膠體幾丁質的效果遠高于ChiA單獨催化。

探究了溫度、pH值、膠體幾丁質質量濃度、雙酶添加比對雙酶協同催化體系的影響。雙酶協同催化體系的最適反應溫度為30 ℃，最適pH值為6，雙酶添加比對催化體系影響較小，ChiA與HJ5N比例2∶1即可。在上述最優反應條件下以40 g/L蝦殼幾丁質（膠體幾丁質11.4 g/L）為底物時，產物GlcNAc質量濃度為9.11 g/L，收率達80%。當蝦殼幾丁質上升到90 g/L（膠體幾丁質30.3 g/L）時，GlcNAc質量濃度為17.55 g/L，收率為58%，該收率顯著高于Ma Wenlong等[35]通過微生物發酵法制備GlcNAc的收率37%。在酶法制備GlcNAc反應過程中，底物多糖膠體幾丁質質量濃度升高會導致整個催化體系的黏度上升，進而影響ChiA和HJ5N的活力，使GlcNAc整體收率下降。研究結果為酶法制備GlcNAc的工業應用提供了一種有效策略。