西洋參細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立

龐富洲，韋坤華,，王 碩，邱 莉，梁 瑩，韋 范，秦雙雙，強寶寶，繆劍華，,*

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 廣西，南寧 530021；2.廣西藥用植物園，廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室 廣西，南寧 530023；3.廣西藥用植物園，廣西壯族自治區(qū)中藥資源智慧創(chuàng)制工程研究中心 廣西，南寧 530023；4.廣西藥用植物園，西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室 廣西，南寧 530023）

西洋參（）是五加科（）人參屬多年生草本藥用植物。現(xiàn)代化學(xué)及藥理學(xué)研究表明，西洋參的主要有效成分是人參皂苷，其具有保護心血管、抗癌、抗炎、提高免疫力等功效。目前，西洋參的栽培方式主要為播種繁殖，培育時間長，種植成本高，而且因為農(nóng)藥的使用、病蟲害的侵襲、天氣的變化以及種植地的不同，導(dǎo)致西洋參產(chǎn)品質(zhì)量高低不一。因此，尋找一種穩(wěn)定、高效獲得良好的西洋參組織的方法實屬必要。

植物組織培養(yǎng)方法具有不受環(huán)境因素的影響、培養(yǎng)過程易操作、培養(yǎng)條件易調(diào)控等優(yōu)點。可以利用植物組織培養(yǎng)手段，建立西洋參細胞懸浮培養(yǎng)體系，從而穩(wěn)定、高效地獲得良好的西洋參組織。例如周倩耘等黑枸杞愈傷組織建立細胞懸浮培養(yǎng)體系，實現(xiàn)黑枸杞細胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化；姜鴻運等通過建立水飛薊細胞懸浮培養(yǎng)體系，優(yōu)化細胞培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)了不同因子對水飛薊賓積累的影響。

本試驗采用美國本土西洋參誘導(dǎo)出的愈傷組織作為外植體，通過正交試驗研究不同激素對西洋參愈傷組織快速生長的影響、觀察西洋參細胞懸浮培養(yǎng)過程中細胞生長動態(tài)變化，以及研究了搖床轉(zhuǎn)數(shù)、光照及接種量對細胞生長的影響，旨在完善西洋參細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立，也為西洋參細胞擴大培養(yǎng)及有效成分的提取提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

超凈工作臺（型號：NU-425-600），搖床（型號：3500 STD），立式滅菌鍋（型號：MLS-3751L），pH測試儀（型號：STARTER 2100），天平（型號：E-Series Balances）

1.2 實驗材料

實驗外植體經(jīng)美國中田納西州立大學(xué)高瑩教授鑒定為西洋參愈傷組織。水為滅菌超純水，MS培養(yǎng)基（Phyto-Tech LABS公司，美國），2,4-D試劑（PhytoTech LABS公司，美國），KT試劑（PhytoTech LABS公司，美國），NAA試劑（PhytoTech LABS公司，美國）。

2 實驗方法

2.1 愈傷組織生長研究

設(shè)計正交試驗表，以三因素三水平的正交分析方法研究2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D），萘乙酸（NaPhthaleneacetic Acid，NAA），激動素（6-Furfurylaminopurine，KT）三種激素對西洋參愈傷組織增殖的影響，30d后觀察其增殖情況，重復(fù)三次。培養(yǎng)基增殖效果指標：愈傷組織增殖倍數(shù)；愈傷組織增殖倍數(shù)=接種后愈傷組織鮮重/接種前愈傷組織鮮重。正交試驗表詳情見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2.2 西洋參懸浮細胞培養(yǎng)及生長動態(tài)變化研究

愈傷組織繼代兩次之后，選擇生長旺盛、結(jié)構(gòu)疏松，易于分散的愈傷組織，將1 g愈傷組織用手術(shù)刀切碎后接種至含30mL液體培養(yǎng)基(MS+2,4-D 1.0 mg·L+KT 0.1 mg·L+蔗糖30 g·L)的125mL的錐形瓶中，每隔4d停止培養(yǎng)其中一個培養(yǎng)瓶，用濾紙過濾混合物，收集濾紙上的細胞稱鮮重。將測完鮮重的細胞放入35℃烘干箱中，待完全干燥后（2d）記錄干重。每組設(shè)3個平行對照。培養(yǎng)條件：在轉(zhuǎn)數(shù)為100 r·min的搖床上培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，相對濕度70%，暗培養(yǎng)。

2.3 搖床轉(zhuǎn)速對西洋參細胞生長的影響

為了探明搖床轉(zhuǎn)數(shù)對細胞生長的影響，每個培養(yǎng)瓶中接種1g愈傷組織，將接種的培養(yǎng)瓶分別置于轉(zhuǎn)數(shù)為80，100，120 r·min的搖床上進行培養(yǎng)，24d后停止培養(yǎng)，用濾紙過濾混合物，收集濾紙上的細胞稱鮮重。將測完鮮重的細胞放入35℃烘干箱中，待完全干燥后(2d）記錄干重。每組設(shè)3個平行對照。

2.4 光照對西洋參細胞生長的影響

為探明光照對西洋參細胞生長的影響，每個培養(yǎng)瓶中接種1g愈傷組織，將接種的培養(yǎng)瓶分別置于無光和16h光照8 h黑暗條件下，在轉(zhuǎn)數(shù)為120 r·min的搖床上進行培養(yǎng)，24d后停止培養(yǎng)，用濾紙過濾混合物，收集濾紙上的細胞稱鮮重。將測完鮮重的細胞放入35℃烘干箱中，待完全干燥后(2d）記錄干重。每組設(shè)3個平行對照。

2.5 接種量對西洋參細胞生長的影響

為探明接種量對人參細胞生長的影響，在每個培養(yǎng)瓶中分別接種1，1.5，2g西洋參愈傷組織，將接種的培養(yǎng)瓶置于轉(zhuǎn)數(shù)為120 r·min的搖床上進行培養(yǎng)，暗培養(yǎng)。24d后停止培養(yǎng)，用濾紙過濾混合物，收集濾紙上的細胞稱鮮重。將測完鮮重的細胞放入35℃烘干箱中，待完全干燥后(2d）記錄干重。每組設(shè)3個平行對照。

2.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和spss19.0軟件統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，所得數(shù)據(jù)均為重復(fù)3次的平均值，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 激素2,4-D、KT、NAA對西洋參愈傷組織增殖的影響

選取2,4-D、KT、NAA因素，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究其9種組合對西洋參愈傷組織增殖的影響，在暗培養(yǎng)30d后，統(tǒng)計愈傷組織的增殖倍數(shù)。通過表2觀察分析可知，極差R的值越大，表明該因素對西洋參愈傷組織增殖的影響就越大。由此可知，對西洋參愈傷組織增殖的影響為：2,4-D>KT>NAA,說明2,4-D對西洋參愈傷組織增殖的影響是最大的。從表2可知，0.5 mg·L2,4-D對應(yīng)的K值大于1.0 mg·L2,4-D和2.0 mg·L2,4-D對應(yīng)的K值，即2,4-D的均值K1>K2>K3，說明0.5 mg·L濃度的2,4-D對西洋參愈傷組織增殖的影響最大。同理，KT的均值K1>K3>K2,NAA的均值K1>K3>K2。故在本實驗中，最適合西洋參愈傷組織增殖的激素組合為0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT+0.2mg/L NAA，見表2。

表2 不同激素2,4-D，KT和NAA對西洋參愈傷組織生長影響的正交試驗結(jié)果

3.2 西洋參細胞生長動態(tài)變化

西洋參細胞的鮮重與干重的變化趨勢類似，隨著培養(yǎng)時期呈增加的趨勢，從培養(yǎng)到第4d，細胞的鮮重和干重增長緩慢，從第5d到第8d，細胞鮮重和干重開始緩慢增加，從第9d到24d，細胞鮮重和干重快速增加，細胞培養(yǎng)24d之后，細胞鮮重開始降低，干重增長速度減緩，見圖1和圖2。

圖1 西洋參細胞懸浮培養(yǎng)過程中細胞鮮重的變化

圖2 細胞懸浮培養(yǎng)過程中細胞干重的變化

3.3 搖床轉(zhuǎn)速對西洋參細胞生長的影響

將 搖床轉(zhuǎn) 速 分 別設(shè)置 為80 mg·L、100 mg·L、120 mg·L，培養(yǎng)24天后發(fā)現(xiàn)隨著轉(zhuǎn)速的提高，細胞的鮮重、干重也在逐步增加，在搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為120 r·min的時候，西洋參細胞的鮮重和干重得到最高值。將西洋參細胞的鮮重和干重進行差異分析，結(jié)果顯示無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）見圖3。

圖3 不同轉(zhuǎn)速對西洋參細胞生長的影響

3.4 不同光照對西洋參細胞生長的影響

將西洋參細胞分別置于16/8 h的光照和完全黑暗的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)24d后，測量細胞鮮重和干重得知，西洋參細胞在16/8h光照培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng)下的鮮重和干重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明光照的有無在培養(yǎng)西洋參細胞時沒有差別，見圖4。

圖4 不同光照對西洋參細胞生長的影響

3.5 不同接種量對西洋參細胞生長的影響

為了研究細胞初始接種量對其生長的影響，在培養(yǎng)瓶中分別接入1g、1.5g、2g西洋參愈傷組織進行培養(yǎng)。24d后測量細胞鮮重的干重的時候發(fā)現(xiàn)，隨著細胞初始接種量的增加，西洋參細胞的鮮重和干重也在增加。然而，在接種量對西洋參細胞生長的研究中，1g和1.5g的細胞接種量其增殖倍數(shù)相差不大，而2g細胞接種量的增殖倍數(shù)低于其他接種量的增殖倍數(shù)，表明細胞的生長受到了抑制。綜上，在30mL的培養(yǎng)基中接種1.5g細胞最適合細胞鮮重和干重的積累，經(jīng)過對西洋參細胞鮮重和干重的差異性分析，1.5g和2g對西洋參細胞鮮重和干重的積累顯著高于1.5g接種量，見圖5。

圖5 不同接種量對西洋參細胞生長的影響

4 討論

在研究西洋參愈傷組織增殖的實驗中，通過正交分析實驗結(jié)果的R值可知，激素2,4-D是促進西洋參愈傷組織增殖最主要的影響因素。在正交分析結(jié)果表中，0.5 mg·L2,4-D對應(yīng)的K值>1.0 mg·L2,4-D對應(yīng)的K值>2.0 mg·L2,4-D對應(yīng)的K值,說明低濃度的2,4-D更有利西洋參愈傷組織的增殖。在Chakraborty,N.的實驗研究中，0.5 mg·L的2,4-D是植物愈傷組織的形成的最佳濃度，高濃度的激素會影響愈傷組織的生成量和形成時間。

西洋參細胞的生長是一個動態(tài)變化的過程。西洋參細懸浮培養(yǎng)初期，細胞正處于新環(huán)境，需要時間適應(yīng)以便于自身更好的生長發(fā)育，該過程為西洋參細胞生長的適應(yīng)期；在西洋參細胞懸浮培養(yǎng)中期，細胞在充足的營養(yǎng)條件下，進入快速生長狀態(tài)，細胞數(shù)量快速增加，該過程為西洋參細胞生長的快速生長期；在西洋參細胞懸浮培養(yǎng)末期，細胞數(shù)目眾多，營養(yǎng)物質(zhì)稀少，同時細胞在培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生一些阻礙生長發(fā)育的物質(zhì)，導(dǎo)致西洋參細胞在培養(yǎng)末期生長速度放緩甚至細胞的數(shù)量會減少，該過程為西洋參細胞生長的衰退期。西洋參細胞生長的動態(tài)變化過程和Beigmohamadi研究的白花丹細胞懸浮培養(yǎng)的生長趨勢相一致。

懸浮培養(yǎng)技術(shù)會對植物細胞產(chǎn)生剪切力，不同種類的植物細胞對剪切力的敏感度不一樣，剪切力過高，會對細胞造成機械損傷，容易引起細胞死亡；同時，在植物細胞懸浮培養(yǎng)的過程中，植物細胞有形成細胞簇的傾向，細胞聚集體過大，會導(dǎo)致細胞聚集中心缺氧，因而剪切力過低，不利于細胞團形成分散狀態(tài)，并且會導(dǎo)致細胞不能充分的吸收營養(yǎng)物質(zhì)，生長速率減慢。植物細胞懸浮培養(yǎng)中，剪切力的高低取決于轉(zhuǎn)速的大小，轉(zhuǎn)速越大，剪切力越大。因而搖床的轉(zhuǎn)速不能過低，也不能過高。本實驗中，不同轉(zhuǎn)速對西洋參細胞鮮重和干重的積累無顯著影響（P>0.05）,其原因可能為搖床轉(zhuǎn)速的設(shè)置范圍太窄，搖床轉(zhuǎn)速對西洋參細胞的影響不明顯。光照的有無對西洋參細胞的生長無影響，與Kumar,S.S.的研究中得出的光能促進紅毛菊（）愈傷組織鮮重和干重的積累的結(jié)果不一致，其原因可能為西洋參本身是喜陰植物，對光的需求不高。在本實驗中，最高的接種量為2g，雖然收獲了最高的生物量，但是增殖倍數(shù)（1.23）不如1.5g接種量的增殖倍數(shù)（1.48），其原因可能為接種量過多，細胞密度大，在懸浮培養(yǎng)末期，營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，西洋參細胞不能正常生長。因而，西洋參細胞懸浮培養(yǎng)的接種量也不是越多越好。綜上，從本研究中，最適和西洋參愈傷組織增殖的激素配方為：MS+0.5mg·L2,4-D+0.1 mg·LKT+0.2 mg·LNAA，西洋參細胞懸浮培養(yǎng)最佳繼代時間為24d，1.5g愈傷組織接種于30mL液體培養(yǎng)基中為最佳接種量，搖床和光照對西洋參細胞生長無顯著影響。