基于基因組學(xué)與代謝組學(xué)分析腸道菌群及其代謝物改變與心力衰竭發(fā)生的相關(guān)性

李 麗，張 昕，鄒 琳

心力衰竭(簡稱心衰)患者多數(shù)預(yù)后不佳，有臨床癥狀患者的5年存活率與惡性腫瘤相仿，且心衰的發(fā)病率持續(xù)增長，正在成為21世紀(jì)最重要的心血管病癥之一。近年來，胃腸道系統(tǒng)與心衰發(fā)生的相關(guān)性日益受到關(guān)注。研究[1]證實(shí)，由右心衰導(dǎo)致的血流動(dòng)力學(xué)問題，與心衰和預(yù)后不良有關(guān)，可能的病理機(jī)制為腸道有害菌群生長，有益菌群減少，菌群代謝物氧化三甲胺(trimethylamine oxide,TMAO)增多[2]。該研究通過制作異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)誘導(dǎo)的心衰大鼠模型，對(duì)比心衰組與對(duì)照組腸道菌群和血清中TMAO水平的差異，探討腸道菌群參與心衰的發(fā)生發(fā)展的途徑，為指導(dǎo)臨床心衰治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料60只清潔級(jí)3月齡的Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量230～250 g，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。ISO購自大連美侖生物有限公司；超純水Mill-Q(美國Millipore公司)、彩色多普勒超聲診斷儀(IE-33)購自飛利浦電器科技集團(tuán)(中國)有限公司；高效液相色譜儀(AB SciexExionLCTMAD)、質(zhì)譜儀(AB Sciex QTRAP?6500+)、糞便DNA提取試劑盒(天根)、紫外分光光度計(jì)購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；引物由上海生工生物有限公司合成；Bio-rad T100梯度PCR儀、PCR產(chǎn)物純化試劑盒(GeneJET膠回收試劑盒)購自美國Thermo Scientific公司；建庫試劑盒購自美國Illumina公司、高通量測序儀(NovaSeq 6000)、NovomMgic云平臺(tái)等。

1.2 方法

1.2.1Wistar大鼠心衰模型的建立 60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為心衰組和對(duì)照組，每組各30只，并編號(hào)。心衰組予以腹股溝皮下注射ISO，對(duì)照組注射生理鹽水。用0.9%生理鹽水溶解粉劑ISO，濃度為20 g/L，按9 ml/(kg·d)注射，隔天1次，共注射2次，為預(yù)防皮膚壞死，第2次注射另一側(cè)，所有大鼠用藥后正常進(jìn)食和活動(dòng)，飼養(yǎng)6周[3]。注射ISO后，心衰組3只大鼠死亡，均于注射藥物后24 h內(nèi)死亡。對(duì)照組未注射ISO，無動(dòng)物死亡。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)比對(duì)照組均值降低20%以上[3]。造模結(jié)果：心衰組共有27只大鼠存活，有6只不符合心衰標(biāo)準(zhǔn)，舍棄，余21只造模成功。

1.2.2超聲心動(dòng)圖檢查 造模6周后，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉。麻醉成功后，將大鼠四肢及頭部固定在木板上，取仰臥位，用備皮刀將大鼠胸部體毛剃除干凈。由同一位有經(jīng)驗(yàn)的彩超醫(yī)生用飛利浦彩色超聲診斷儀的S4-2高頻探頭，在二維超聲引導(dǎo)下，選取大鼠左室乳頭肌短軸切面，測量左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diamete,LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end contractile diameter,LVESD)、LVEF、短軸縮短率(fractional shortening,FS)。每只大鼠測8個(gè)心動(dòng)周期，取其平均值。

1.2.3高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定血清中TMAO水平 留取標(biāo)本前，將大鼠禁食一夜，次日將大鼠用水合氯醛麻醉后，開腹，找到腹主動(dòng)脈，采集空腹血樣，靜置30 min后，-4 ℃，3 000 r/min 離心15 min，分離出上層血清，凍存于-80 ℃冰箱中待測。使用TMAO標(biāo)準(zhǔn)品制備濃度為1 mg/ml混標(biāo)線性母液，使用乙腈稀釋線性母液得到系列濃度分別為100 000、50 000、10 000、5 000、1 000、500、100、50、10、5 ng/ml的工作液。配制一定濃度的Creatinine-d3和L-Carnitine-d9溶液，混勻得到內(nèi)標(biāo)溶液。將樣本稀釋后，渦旋混勻，離心，取上清，加入混合內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液，渦旋混勻，離心，取上清液向高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀中進(jìn)樣進(jìn)行分析[4]。

1.2.4腸道微生物檢測與生物學(xué)分析 腹主動(dòng)脈取血后，迅速留取盲腸糞便，速置于液氮中冷凍，保存于-80 ℃冰箱中，用糞便DNA提取試劑盒提取糞便中的DNA，紫外分光光度法檢測DNA的濃度和純度，使用波碎儀將檢測合格的DNA樣品隨機(jī)打斷成約350 bp的片段，然后通過末端修復(fù)、加測序接頭、純化、加A尾、PCR擴(kuò)增等步驟完成文庫構(gòu)建。庫檢合格后，按照有效濃度及目標(biāo)數(shù)據(jù)量的需求，把不同文庫pooling后進(jìn)行高通量測序[5]。對(duì)測序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和質(zhì)控，得到高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)，再進(jìn)行嵌合體過濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)，對(duì)所有樣本的有效數(shù)據(jù)以97%的一致性進(jìn)行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類，然后對(duì)OTUs的序列通過與數(shù)據(jù)庫Silva132比對(duì)，進(jìn)行物種注釋。使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線，使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算α多樣性指數(shù)，繪制α多樣性盒圖；為了尋找各分類水平(界、門、科、目、綱、屬、種)下，組間的差異物種，使用R軟件做組間的t檢驗(yàn)，找出差異顯著(P<0.05)的物種。默認(rèn)展示門水平的結(jié)果，若門水平無顯著差異物種則展示下一個(gè)層級(jí)，以此類推。使用R軟件進(jìn)行兩組間差異顯著性的Anosim分析，檢驗(yàn)組間差異是否大于組內(nèi)差異，來驗(yàn)證分組的合理性。使用LFfSe軟件進(jìn)行線性判別分析(lineardiscriminatanalysis，LDA)默認(rèn)預(yù)設(shè)值為4，即認(rèn)為組間具有顯著差異。使用R軟件(Version 3.1.0)繪制FAPROTAX聚類熱圖，分析兩組大鼠糞便菌群功能差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能比較與對(duì)照組比較，心衰組LVEDD、LVESD增大，LVEF和FS降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 兩組大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能

圖1 兩組大鼠心功能檢查情況A:對(duì)照組;B:心衰組

2.2 血清TMAO含量檢測結(jié)果與對(duì)照組比較，心衰組血清中TMAO含量升高[(373.38±107.96) ng/mlvs(957.74±71.35) ng/ml,P<0.05]。

2.3 兩組大鼠腸道糞便高通量測序結(jié)果

2.3.1微生物注釋結(jié)果與分類特征 每組送檢10份樣本，共獲得268 182個(gè)序列，通過與數(shù)據(jù)庫Sil-va132比對(duì)，進(jìn)行物種注釋，并對(duì)不同分類層級(jí)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)：4 699個(gè)OTUs中，能夠注釋到數(shù)據(jù)庫的OTUs數(shù)目為4 699(100.00%)，注釋到界水平的比例為100.00%，門水平的比例為83.78%，綱水平的比例為81.68%，目水平的比例為71.85%，科水平的比例為58.08%，屬水平的比例為30.01%，種水平的比例為3.30%。物種豐度聚類熱圖分析兩組大鼠糞便主導(dǎo)菌群：根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣本或分組在門水平上最大豐度排名前十的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖，以便直觀查看各樣本在同一分類水平上，相對(duì)豐度較高的物種及其比例。門水平物種相對(duì)豐度柱形圖(見圖2)，圖中可以見到兩組排名前6位的物種一致，含量不同。腸道菌群分類特征為：在門水平上，占據(jù)主導(dǎo)地位的主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門；在屬水平上的優(yōu)勢物種為乳桿菌屬、Allobaculum屬、杜氏桿菌屬。得到OTUs后，繪制稀疏曲線(見圖3)可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，本研究結(jié)果中各曲線漸近平坦，測速數(shù)據(jù)量達(dá)到預(yù)期。

圖2 門水平上的物種相對(duì)豐度柱形圖

圖3 稀釋曲線圖

2.3.2兩組糞便樣本菌群多樣性與差異物種分析 經(jīng)α多樣性分析，兩組ACE指數(shù)(P=0.68)、Goods Coverage指數(shù)(P=0.47)、Chao指數(shù)(P=0.49)、Observed Species指數(shù)(P=0.82)、Shannon指數(shù)(P=0.71)、Simpson指數(shù)(P=0.65)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩組間在物種多樣性上無顯著差異。見圖4。

圖4 Alpha多樣性分析各指數(shù)箱式圖

PCoA結(jié)果顯示，兩組基于Weighted Unifrace的對(duì)照組及心衰組各10個(gè)標(biāo)本，每組選取3個(gè)樣本作圖，A為心衰組，B為對(duì)照組，下同橫坐標(biāo)為從某個(gè)樣品中隨機(jī)抽取的測序條數(shù)，縱坐標(biāo)為基于該測序條數(shù)得到的OTU數(shù)量β多樣性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 β多樣性的PCoA分析圖

2.3.3兩組間菌群差異物種分析 Anosim分析結(jié)果R=0.111 1，P>0.05，表明兩組間有差異，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。t檢驗(yàn)組間物種差異分析圖顯示兩組間有差異的菌群前5位為Acidobacteriota門、維魯士菌門、硝化螺旋菌門、Methylomirabilota門、泉古菌門(P<0.05)。其他菌群的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。LEfSe分析顯示心衰組與對(duì)照組間具有顯著差異(LDA絕對(duì)值>4)的菌種為鼠乳桿菌(Lactobacillusmurinus)、Acidobacteriota、Bacteria，見圖7。

圖6 t檢驗(yàn)組間物種差異分析圖

左圖中每個(gè)條形分別表示在分組間豐度差異顯著的物種在每個(gè)組中的均值。右圖為組間差異置信度展示，展示結(jié)果的最右端是對(duì)應(yīng)差異物種的組間顯著性檢驗(yàn)P值

圖7 LDA值分布柱狀圖

3 討論

腸道菌群在調(diào)節(jié)腸道炎癥及腸道免疫功能方面極其重要，腸道菌群紊亂與腸道炎癥的發(fā)生直接相關(guān)[6]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和臨床研究[7]表明，多種炎癥機(jī)制可導(dǎo)致心臟重塑，功能障礙和慢性衰竭，促炎性生物標(biāo)志物和細(xì)胞因子升高與心力衰竭的發(fā)病率和死亡率相關(guān)。本研究顯示心衰組及對(duì)照組差異最顯著的8類細(xì)菌中，Acidobacteriota、Bacteria這兩種菌群范圍太廣，不具有分析意義，鼠乳桿菌、Acidobacteriota門、維魯士菌門、硝化螺旋菌門、Methylomirabilota門、泉古菌門菌群豐度在心衰組中顯著降低(P<0.05)。鼠乳桿菌和維魯士菌門中的代表黏液曲霉菌具有提高腸道免疫功能，改善腸道炎癥狀態(tài)的功能[8-9]。目前對(duì)于Acidobacteriota門、硝化螺旋菌門、Methylomirabilota門及泉古菌門在臨床上的研究非常少，對(duì)于其確切的作用尚不明確。2018年一項(xiàng)研究[10]發(fā)現(xiàn)，阻塞性睡眠呼吸暫停患者與非阻塞性睡眠呼吸暫停患者的支氣管肺泡灌洗液的微生物組譜出現(xiàn)了差異，差異菌群中包括Acidobacteriota門，但無法確認(rèn)Acidobacteriota的作用。2020年一項(xiàng)關(guān)于癌性和非癌性卵巢組織之間細(xì)菌分布差異的研究[11]顯示，泉古菌門在癌性卵巢中明顯減少，該菌同樣在心衰組中明顯減少，意味著泉古菌門與卵巢癌及心衰負(fù)相關(guān)。綜上，腸道菌群可能通過降低腸道免疫功能及使腸道處于炎癥狀態(tài)，進(jìn)而參與心衰的發(fā)生發(fā)展。

研究[12]證實(shí)，TMAO可促使小鼠心肌細(xì)胞橫管網(wǎng)絡(luò)損傷和Ca2+操縱功能障礙，影響心臟收縮和舒張功能，從而促進(jìn)心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，心衰組大鼠血清TMAO水平明顯升高(P<0.05)，并且心衰組的擬桿菌亞種(0.001 163vs0.000 390)和腸桿菌科(0.004 763vs0.000 787)的平均豐度均高于對(duì)照組。相關(guān)研究顯示雖然內(nèi)在機(jī)制尚不清楚，但脫鐵桿菌科、普沃雷氏菌科、腸桿菌科、擬桿菌亞種(B.thetaiotaomicron和B.fragilis)以及厚壁菌門中Erysipelotrichia類參與TMAO代謝[13]。因此，TMAO可能是腸道菌群參與心衰的發(fā)生發(fā)展的另一個(gè)重要途徑。

本研究顯示，與對(duì)照組比較，不論是α多樣性還是β多樣性，心衰組腸道菌群物種組成多樣性無明顯差異，說明心衰的發(fā)生發(fā)展可能與腸道菌群多態(tài)性以及整體比例的失衡無關(guān)，但不能排除樣本量不足導(dǎo)致的假陰性。

本研究也存在著一定的局限性，首先，動(dòng)物模型不一定全面模擬心衰惡病質(zhì)患者的腸道情況。第二，大鼠被注射ISO后心率加快，從而致使心肌損傷，這樣的病理生理過程制造的心衰模型不能全面代替臨床上多見的如基因、病毒、酒精、缺血等原因所致的心衰。