獐牙菜苦苷對PC12細胞氧糖剝奪再灌注損傷的保護作用及機制

王 慧，蘭小兵，鄭 萍，王 晴，馬 琳，楊佳美，劉 寧，3，余建強，3

〔1.蘇州大學附屬獨墅湖醫院（蘇州大學醫學中心），江蘇 蘇州 215000；2.寧夏醫科大學藥學院，寧夏 銀川 750004；3.寧夏特色中醫藥協同創新中心，寧夏藥物創新與仿制藥研究重點實驗室，寧夏 銀川 750004〕

腦卒中具有高死亡率和高致殘率的特點［1-2］，嚴重威脅人類健康，其中約87%屬于缺血性腦卒中，又稱腦缺血，是指由于各種原因引起的腦供血不足，缺血缺氧導致腦組織的軟化和壞死［3-4］。對于缺血性腦卒中的治療，目前臨床所用藥物主要為組織纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen activator，tPA）等溶栓藥物，然而由于其適應證和治療時間窗窄，僅有2%～5%腦卒中患者能接受tPA治療，其中50%能達到再灌注；此外，使用tPA治療恢復血液供應后，其腦功能不但沒有恢復，反而加重了腦損傷，稱為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemic/reperfusion injury，CIRI），限制了tPA等溶栓藥物在臨床上的使用。因此，進一步尋找療效好、毒性低的抗缺血性腦損傷的神經保護藥物，仍是目前亟待解決的重大問題。

CIRI的機制復雜，大量研究證實，氧化應激在其發病機制中有重要作用，再灌注時，活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平急劇增加，引起線粒體損傷、鈣超載、線粒體膜電位水平發生改變、能量代謝障礙和神經元凋亡［5-6］。因此，可以通過抑制氧化應激，從而減少CIRI［7］。獐牙菜苦苷（swertiamarin，Swe）是從中藥秦艽（Gentianamacrophylla，Pall）中提取的主要活性成分之一。秦艽有多種藥理作用，包括抗炎、鎮痛、抗腫瘤及保護肝和心腦血管［8-9］。有研究表明，秦艽的水煎液對家兔全腦缺血損傷模型有一定的保護作用［10］。Swe具有抗炎、抗氧化和鎮靜等藥理活性［11］。本課題組前期研究發現，Swe對CIRI的ICR小鼠具有神經保護作用，該作用與激活核轉錄因子紅系2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2），減少氧化應激損傷有關［12］；但對PC12細胞氧糖剝奪再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）損傷是否具有保護作用未見報道。因此，本研究通過建立PC12細胞OGD/R損傷模型，探討Swe的神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 PC12細胞和細胞培養

PC12細胞由中國科學院昆明動物研究所提供。將PC12細胞用含10%胎牛血清的1640培養基置含5% CO2的37℃恒溫培養箱中培養。

1.2 藥品、試劑和主要儀器

Swe（純度＞99%），北京中科質檢生物技術有限公司；MTT、Fluo-3 AM熒光探針鈣離子濃度檢測試劑盒和JC-1熒光探針線粒體膜電位檢測試劑盒，上海碧云天生物技術公司；胎牛血清和胰蛋白酶，美國Gibco公司；尼莫地平（nimodipine）注射液，德國 Bayer公司；Earle’s平衡鹽溶液（Earle′s balanced salt solution，EBSS），北京博奧拓達科技有限公司；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，瑞士Roche公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒和活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶3和活化胱天蛋白酶3多克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗，英國Abcam公司。細胞培養箱（HF160W），力康生物醫療科技控股有限公司；酶標儀（Model 550），美國Bio-Rad生命醫學產品有限公司；倒置顯微鏡（BH-NIC-B），日本奧林巴斯光學有限公司；激光共聚焦顯微鏡（TCS-SP），德國萊卡顯微系統有限公司。

考慮到環境中光線條件的影響，物體本身的顏色會發生變化，具體到本研究的具體做法是在普通攝像頭采集酶標板區域圖像時，將酶標板放在一塊均勻的Led燈板上，使酶標板孔受到均勻的光照這樣可以減少光線等環境因素帶來顏色特征值計算的誤差.

1.3 PC12細胞OGD/R模型構建和分組給藥

MTT實驗結果（圖1）顯示，與細胞對照組〔（98.3±1.6）%〕比較，OGD/R模型組細胞存活率顯著降低至（46±4）%（P＜0.01）；Swe 1和10 μmol·L-1組細胞存活率分別為（58±3）%和（65.5±1.6）%，尼莫地平組為（67.7±2.6）%，與模型組比較，均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

PC12細胞氧化應激水平檢測結果（圖5）顯示，與細胞對照組比較，OGD/R模型組PC12細胞ROS和 MDA 水平顯著升高（P＜0.01），SOD，CAT和GSH-Px的活性顯著降低（P＜0.01）；與OGD/R模型組比較，Swe 0.1，1 和 10 μmol·L-1組及尼莫地平組細胞ROS和MDA水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），SOD，CAT 和 GSH-Px的活性顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

1.4 MTT法檢測PC12細胞存活率

將PC12細胞接種在96孔板中，每孔6×103細胞，細胞OGD/R模型構建和分組給藥同1.3，每孔加入20 μL MTT（5 g·L-1），在培養箱中孵育4 h，輕輕吸掉上清，加入DMSO溶液150 μL，震蕩10 min后，用酶標儀在波長490 nm條件下測定各組吸光度值（A490nm）。

1.5 比色法檢測PC12細胞LDH漏出率

LDH漏出率檢測結果（圖2）顯示，與細胞對照組〔（5.5±1.1）%〕比較，OGD/R模型組LDH漏出率增加至（19.4±1.2）%（P＜0.01）；與模型組比較，Swe 1和10 μmol·L-1組和尼莫地平組LDH漏出率明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。

1.6 Fluo-3AM熒光探針法檢測PC12細胞內Ca2+濃度

將PC12細胞接種在60 mm的培養皿中，實驗分為細胞對照組、OGD/R模型組和Swe（10 μmol·L-1）組。細胞OGD/R模型構建和給藥方法同1.3。按全蛋白提取試劑盒說明操作，裂解細胞，用BCA蛋白檢測試劑盒檢測細胞總蛋白含量，通過10% SDS-PAGE電泳分離蛋白并轉印到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉孵育封閉2 h后加入一抗（Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶3和活化的胱天蛋白酶3抗體分別以1∶1000，1∶1000，1∶800和1∶500稀釋），4℃孵育過夜；加入二抗（1∶2000稀釋）室溫孵育2 h，ECL顯色后曝光檢測蛋白條帶印跡。利用Image J軟件測定蛋白條帶積分吸光度值，用目標蛋白與內參蛋白條帶積分吸光度值的比值表示目標蛋白的相對表達水平。用活化蛋白與總蛋白條帶積分吸光度值的比值表示蛋白活化水平。

上式通過將低值變異概率動態賦予低適應度個體，促使其發生變異，有效保護了優異個體。在與變異概率比較后，再揀選n對個體，利用配對算子遺傳形成子代新個體。當前配對算子中，擴展算術配對算子通用性較好[19]，計算公式為：

1.7 JC-1熒光探針法檢測PC12細胞線粒體膜電位

將PC12細胞接種在共聚焦皿中，細胞OGD/R模型構建和分組給藥同1.3。棄培養基，加入根據試劑盒說明書提前配制好的JC-1染色工作液，在培養箱中染色25 min，之后用JC-1染色緩沖液洗3遍，加入2 mL 1640培養基在顯微鏡下觀察并采集圖像。線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）較高時，JC-1在線粒體中形成聚合物，產生紅色熒光；MMP較低時，JC-1為單體，產生綠色熒光［13］。通過計算各組紅、綠熒光強度比值反映PC12細胞MMP。

1.8 比色法檢測SOD、CAT和GSH-Px的活性及ROS和MDA的含量

將細胞種植在35 mm培養皿中，細胞OGD/R模型構建和分組給藥同1.3。棄掉培養液，細胞用PBS洗1遍。按照試劑盒說明書操作，用熒光分光光度計檢測SOD，CAT和GSH-Px的活性及ROS和MDA含量。

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1.9 流式細胞術檢測細胞凋亡

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計學處理。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，計數資料以頻數及百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

1.10 Western印跡法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達及胱天蛋白酶3活化水平

將細胞接種在激光共聚焦專用培養皿中，細胞OGD/R模型構建和分組給藥同1.3。PC12細胞從培養箱中取出，用PBS洗3遍，每次5 min，按照試劑盒說明書操作，加入Fluo-3 AM工作液孵育30 min，用PBS洗3遍，用激光共聚焦顯微鏡在激發波長488 nm，發射波長527 nm條件下觀察并采集圖像，用Olympus FV10-ASW4.1 Viewer和Image J分析熒光強度，以熒光強度反映細胞內Ca2+濃度。

1.11 統計學分析

2 結果

2.1 Swe對OGD/R損傷的PC12細胞存活率的影響

將PC12細胞從培養箱取出，棄掉培養液，用EBSS輕輕洗3遍，加入適量的EBSS，置37℃恒溫缺氧箱（95% N2和5% CO2）內缺氧4 h（缺氧缺糖）。缺氧結束后輕輕取出培養皿，棄EBSS，換成常規1640培養液進行培養，在37℃CO2培養箱中培養24 h（再灌注）。

將PC12細胞接種在培養皿中，實驗分為細胞對照組、OGD/R模型組、尼莫地平（陽性對照藥）組和Swe（10 μmol·L-1）組。細胞OGD/R模型構建和給藥方法同 11..33。按照AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，收集PC12細胞用冷的PBS洗3遍，用400 μL結合液重懸細胞，加入AnnexinV-FITC在4℃條件下孵育15 min，最后加入反應混合液孵育5 min，用流式細胞儀檢測分析細胞凋亡率。

2.2 Swe對OGD/R損傷的PC12細胞LDH漏出率的影響

細胞OGD/R模型構建和分組給藥同1.3，將PC12細胞從培養箱中取出，收集各組細胞培養液，PBS輕輕沖洗細胞3次，然后用胰酶消化收集細胞，超聲破碎細胞15 s，重復3次得細胞勻漿，根據LDH檢測試劑盒說明書操作流程，用酶標儀在440 nm波長下分別檢測培養液和細胞勻漿的吸光度值（A440nm）。LDH漏出率（%）=培養液A440nm/（培養液A440nm+細胞勻漿A440nm）×100%。

2.3 Swe對OGD/R損傷的PC12細胞內Ca2+濃度的影響

圖3結果顯示，與細胞對照組比較，OGD/R模型組綠色熒光強度顯著增強（P＜0.01），提示細胞內Ca2+濃度升高；與OGD/R模型組比較，Swe 0.1，1和10 μmol·L-1組和尼莫地平組綠色熒光強度減弱，提示Ca2+濃度均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

H5假設成立，感知價值對使用意愿的路徑系數是0.88，說明感知價值是無現金支付使用意愿的主要影響因素，當消費者對無現金支付的整體評價較高，其選擇使用無現金支付的意愿就越大，當消費者整體評價不高，其使用意愿就不高。無論從經濟學理論角度還是數據檢驗結果來看都證實感知價值中介變量選取的合理性。

2.4 Swe對OGD/R損傷的PC12細胞MMP的影響

MMP檢測結果（圖4）顯示，與細胞對照組比較，OGD/R模型組紅/綠熒光比值顯著降低（P＜0.01）；與OGD/R模型組比較，Swe 1和10 μmol·L-1組和尼莫地平組紅/綠熒光比值顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

2.5 Swe對OGD/R損傷的PC12細胞氧化應激水平的影響

實驗分為細胞對照組、OGD/R模型組、尼莫地平（陽性對照藥）組和Swe（0.1，1.0和10.0 μmol·L-1）組。除細胞對照組外，其余各組均進行OGD/R處理，模型組氧糖剝奪4 h后，換成常規培養基繼續培養24 h，尼莫地平組再灌注的同時加尼莫地平12 μmol·L-1，Swe組再灌注的同時分別加Swe 0.1，1.0 和 10.0 μmol·L-1，細胞對照組換成同體積培養基。

式中與分別表征對于決策專家et而言，應急方案epm在指標cn下的實際表現情況相對于期望水平或最低要求值的損益值，t=1,2,,T，m=1,2,,M，n=1,2,,N。

2.6 Swe對OGD/R損傷的PC12細胞凋亡的影響

細胞凋亡檢測結果（圖6）顯示，與細胞對照組比較，OGD/R模型組細胞早期凋亡率和細胞死亡率明顯增加（P＜0.01）；與OGD/R模型組比較，Swe 10 μmol·L-1和尼莫地平顯著降低細胞早期凋亡率和細胞死亡率（P＜0.01）。

2.7 Swe對OGD/R損傷的PC12細胞Bcl-2和Bax蛋白表達及胱天蛋白酶3活化水平的影響

Western印跡檢測結果（圖7）顯示，與細胞對照組比較，OGD/R模型組Bcl-2/Bax比值明顯降低（P＜0.01），胱天蛋白酶3活化水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，Swe 10 μmol·L-1組 Bcl-2/Bax比例明顯升高（P＜0.01），胱天蛋白酶3活化水平明顯降低（P＜0.01）。

3 討論

CIRI的發病機制復雜，大量研究表明，ROS大量產生引起的氧化應激在CIRI的發生發展中起到關健作用。本課題組前期研究發現，Swe在ICR小鼠大腦中動脈栓塞模型上可抗CIRI，具有神經保護作用［12］，且該作用與激活Nrf2信號通路抑制氧化應激損傷有關。本研究采用PC12細胞建立氧糖剝奪4 h、再灌注24 h的體外OGD/R模型，MTT法和LDH漏出率檢測結果表明，Swe組細胞存活率明顯升高，LDH漏出率明顯降低，說明Swe可降低OGD/R引起的PC12細胞損傷。Swe可對抗OGD/R引起的SOD，GSH-PX和CAT活性降低及ROS和MDA含量增加，說明Swe可以減少PC12細胞OGD/R引起的氧化應激損傷。

隨后，她坐在嶺上的一塊大青石上，曬了一會陽光，不知為什么，她走走停停，走得越來越慢了。說穿了做賊心虛，心底里還是有點兒提心吊膽的，她努力使自己鎮定下來，以一種淡定的心態，若無其事地去見她的風影和尚，就像什么事也沒有發生過一樣。這回，她一定要讓他吹一回竹笛子，她要好好的當一次聽眾，聽一聽那久違了的笛聲。她深信，這次的笛聲一定比以往任何時候都要悠揚，悅耳動聽。她笑了起來，笑得比一株山花還要好看，那就繼續笑下去，跟山花秀上一回，俊死那滿山的野花。此時要是帶鏡子，她一定會照上千回百回。她的身子頃刻之間就化作了一株弱柳，如果沒有風扶，肯定會倒了下去。

線粒體功能障礙與氧化應激密切相關。腦缺血再灌注會誘導氧化應激，使ROS的水平增加，改變線粒體膜電位，導致細胞內Ca2+濃度增加。Ca2+超載可引起細胞損傷，進一步加重氧化應激，觸發下游凋亡信號通路的激活。此外，MMP能反映線粒體的功能和損傷程度，MMP的降低最終導致細胞凋亡［14-15］。因此，維持細胞內Ca2+水平和增加MMP可以降低OGD/R引起的PC12細胞損傷。本研究結果表明，Swe顯著抑制OGD/R損傷后PC12細胞內Ca2+超載，提高MMP水平。說明Swe能減少OGD/R引起的PC12細胞氧化應激和維持線粒體功能。

凋亡是腦缺血再灌注細胞死亡的主要方式之一。細胞凋亡受凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的調節，其中促凋亡蛋白會激活下游胱天蛋白酶家族，包括將凋亡執行蛋白胱天蛋白酶3激活成為活化的胱天蛋白酶3，從而引起DNA的損傷和細胞凋亡的產生［16-18］。文獻報道，增加Bcl-2/Bax比例，抑制胱天蛋白酶3活化水平可以減少細胞凋亡［19-21］。本研究中，OGD/R模型組細胞凋亡率增加，Bcl-2/Bax明顯降低，胱天蛋白酶3活化水平明顯增加，Swe可顯著減少OGD/R引起的PC12細胞凋亡。

綜上所述，Swe對PC12細胞OGD/R損傷具有保護作用，且Swe的神經保護作用與抑制氧化應激、減少細胞凋亡有關，此研究結果與前期在ICR小鼠體內研究結果相一致，由此說明Swe有可能作為潛在的抗CIRI的神經保護劑。