不同微生物菌劑對草莓炭疽病防控和土壤微生物群落結構的影響

王明湖， 連瑛， 李雅穎， 謝媛， 徐力斌， 汪國文， 吳愉萍*

(1.寧波市農業農村綠色發展中心，浙江 寧波 315012； 2.浙江省城市環境過程與污染控制重點實驗室中國科學院寧波城市環境觀測研究站，浙江 寧波 315830； 3.杭州彌奧科技有限公司，浙江 杭州 310007； 4.奉化區大堰鎮農業農村辦公室，浙江 寧波 315509； 5.余姚市銀農農業生產資料商店，浙江 寧波 315400)

草莓在全球經濟作物中具有非常重要的地位，近年來，我國草莓產業發展迅速，種植面積和產量均居世界第一位[1]，草莓已經成為最受老百姓歡迎的季節性水果之一，草莓產業的健康發展也是農產品質量安全的重要保障內容。炭疽病是一種高溫、高濕型真菌性病害，為草莓最主要的病害之一，通常南方地區發生較為普遍，主要發生在草莓生產初期，常造成25%～30%減產，嚴重影響草莓的產量和品質[2]。在炭疽病防治過程中農民大量使用化學藥劑，使草莓成為安全風險等級較高的農產品[3-4]。

微生物菌劑是一種防控草莓炭疽病的新的綠色防控技術手段，可以有效減少化學藥劑的使用，增加土壤微生物含量[5]，提高土壤養分有效性[6]，促進草莓植株健康生長[7]，符合國家倡導的綠色發展理念。本文以5種不同的微生物菌劑為研究對象，在大棚草莓種植中參照綠色食品標準施用農藥和肥料，研究在減少化肥和農藥使用的前提下，不同微生物菌劑對草莓炭疽病的抑制作用，進而為草莓炭疽病的綠色防控提供對策。

1 材料與方法

1.1 材料

供試草莓品種為紅顏(紅頰)，屬高感炭疽病品種[8]。

試驗地為浙江省寧波市北侖區一大棚草莓種植基地，地理坐標為121°46′23.49″E，29°51′41.00″N。

土壤pH 4.46，有機質含量為31.0 g·kg-1，水解性氮含量為234 mg·kg-1,有效磷含量為134 mg·kg-1,速效鉀含量為453 mg·kg-1。

供試的5種微生物菌劑由杭州彌奧科技有限公司研制，其中4種為純菌株，代號分別為F2(枯草芽孢桿菌，Bacillussubtilis)、F8(多黏芽孢桿菌，Bacilluspolymyxa)、F11(解淀粉芽孢桿菌，Bacillusamyloliquefaciens)、F12(貝萊斯芽孢桿菌，Bacillusbelais)；1種為復合菌劑，由上述4種菌株混合而成。

1.2 處理設計

試驗設置CK(不施微生物菌劑)、F2、F8、F11、F12和F(由F2、F8、F11、F12菌株組成的復合菌劑)6個處理。菌劑用量：曬干發酵羊糞+6.7%液體菌劑拌勻作基肥使用，每小區施用羊糞15 kg，菌液1 L；移栽時每小區0.5 L菌液稀釋30倍澆根；CK組用自來水代替菌液。每個處理重復3次，采用隨機區組設計。每個小區面積為16 m2。所有小區施肥、用藥均相同，施肥按照NY/T 394—2013《綠色食品 肥料使用準則》，用藥按照NY/T 393—2013《綠色食品 農藥使用準則》。

7月6日施入菜籽餅和石灰氮，翻耕后灌水，覆蓋地膜開始高溫悶棚。8月16日施入其他基肥后開溝整地，整好地后，按照試驗設計，條施經過微生物菌劑或自來水(CK)處理的羊糞。9月11日草莓移栽定植。9月12日按試驗設計方案澆施不同菌液或自來水(CK)。10月9日第二次澆施菌液。11月1日草莓覆蓋地膜。11月7日蓋大棚膜。11月15日蜜蜂進棚，草莓進入始果期。12月29日第一批草莓成熟。次年4月3日草莓采摘結束。草莓達到上市標準后采摘，并記錄每次產量。

1.3 測定參數與方法

密切關注移栽后草莓炭疽病的發病和致死情況，統計各處理草莓病死植株數量。

采集處理前(8月15日)、第二次施用菌液后第3天(10月12日)和掛果后期(次年3月14日)各處理土壤樣品，提取土壤菌群DNA，采取高通量測序的手段，進行真菌和細菌群落結構的分析。分別于處理前(8月15日)、始果期(11月13日)、掛果初期(12月5日)、盛果期(次年1月22日)和掛果后期(次年3月14日)采集微生物菌劑處理土壤混合樣品和CK處理樣品，測定pH值、有機質、水解性氮、有效磷和速效鉀含量。

按照操作說明書進行土壤菌群DNA的提取，使用Power Soil DNA提取試劑盒(美國MoBio)從0.1 g的土壤樣品(冷凍干燥)中提取DNA。所得的DNA最后用100 μL的無菌水洗脫到2 mL離心管中，后保存于-20 ℃以備后續分析。MiSeq高通量測序，細菌16S rRNA與真菌ITS分別用515F和907R、ITS1F和ITS2進行擴增，并在Illumina MiSeq平臺(300×2)上測序。測序數據已提交在BioProject PRJNA 558591的NCBI序列數據庫(SRA)中。pH參照NY/T 1377-2007《土壤pH的測定》方法測定；速效鉀含量參照LY/T 1234—2015《森林土壤鉀的測定》方法測定；水解性氮含量參照LY/T 1228—2015《森林土壤氮的測定》方法測定；有效磷含量參照NY/T 1121.7—2014《土壤檢測 第7部分：土壤有效磷的測定》方法測定；有機質含量參照NY/T 1121.6—2006《土壤檢測 第6部分：土壤有機質的測定》方法檢測。

1.4 數據處理

試驗數據采用DPS V 9.01軟件進行整理并繪制表格，使用SigmaPlot 10.0繪制圖形。高通量測序的原始雙端數據采用Fastq進行數據質控查看、過濾掉低質量的測序結果；再用Usearch進行拼接、修剪到預期的片段大小(300～385 bp)，然后使用USEARCH v6.1.544刪除嵌合體。使用QIIME 1.9.1和UNITE數據庫(12.11)以及BLAST方法，在97%的相似性下，按照Open reference方法來提取操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)。利用R語言v 3.6.0(R Core Team，2019)中“vegan”程序包對細菌和真菌群落進行主坐標分析(PCoA)。

2 結果與分析

2.1 不同微生物菌劑對炭疽病的防治效果

由圖1可知，不同微生物菌劑處理下草莓炭疽病致死情況顯著不同。與CK相比，F2、F8和F11處理組草莓因炭疽病死亡數顯著增加。F12處理與CK處理草莓死亡數無顯著差異。F處理草莓死亡棵數比CK處理顯著減少，死亡率降低。復合菌劑的使用能夠有效抵抗草莓炭疽病的發生，進而增加草莓產量，獲取相對較高的經濟收益。單一菌劑對草莓炭疽病沒有防治效果，但復合菌劑可以顯著降低草莓炭疽病的發病致死現象，這可能和復合菌劑的協同作用有關。該復合菌劑中的微生物可能在環境中發揮了正向作用，改善了土壤微生物的群落結構，提高了土壤養分的有效性，進而增強了作物的抵抗力。或者復合菌劑的微生物在環境中占有絕對優勢，有效抑制了炭疽病菌的生長。具體是哪一種機制產生作用，還有待進一步研究。

不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 不同處理下草莓炭疽病死亡數及死亡降低率

2.2 不同處理對土壤微生物生物量和群落結構的影響

不同處理土壤DNA提取含量在60.97～88.53 ng·μL-1(圖2)。無論是10月12日還是次年3月14日，不同處理間土壤DNA提取含量均無顯著差異。土壤DNA含量可以表征土壤微生物生物量[9]，在本試驗中，不同微生物菌劑處理后，土壤微生物生物量無顯著差異。

細菌主要以變形菌門(相對豐度29.7%)、擬桿菌門(相對豐度11.8%)和綠彎菌門(相對豐度11.0%)為主，微生物菌劑處理后能顯著增加厚壁菌門的相對豐度(圖3)，這與微生物菌劑為厚壁菌門一致。主坐標分析表明，微生物菌劑處理能顯著改變土壤細菌群落結構，使用微生物菌劑后土壤細菌群落明顯改變，但是同一采樣時間不同微生物菌劑處理之間差異不顯著(圖4)。真菌主要以球囊菌門(相對豐度36.7%)和子囊菌門(相對豐度17.4%)為主(圖3)。主坐標分析表明，不同處理之間及不同采樣時期之間土壤真菌群落差異不明顯(圖4)。微生物菌劑的添加能對土壤的細菌群落產生顯著影響，但是對真菌的作用不明顯。

P為供試地塊微生物菌劑處理前(2018年8月15日)采集的土壤樣品，圖3、4同。圖2 不同處理土壤DNA提取含量

1st為10月12日采集的土壤樣品；2nd為3月14日采集的土壤樣品。圖3 不同處理細菌和真菌的群落組成

菌劑處理前樣品采集為8月15日；第一次樣品采集為10月12日；第二次樣品采集為3月14日。圖4 不同處理細菌和真菌的主坐標分析圖

2.3 微生物菌劑對土壤養分含量的影響

整個草莓生長周期，無論是CK組還是微生物菌劑處理組，土壤中養分含量豐富，整體變化趨勢基本一致(表1)。微生物菌劑處理后的土壤pH、水解性氮、有效磷和有機質4個指標均略高于CK組。速效鉀含量則呈負效應，微生物菌劑處理后的土壤較CK組明顯降低，可能與土壤本身速效鉀含量過高，屬于富鉀狀態有關，菌劑處理后調節土壤中鉀含量，向更有利于植物和微生物利用方向轉變有關。

表1 微生物菌劑對土壤營養成分的影響

3 小結

本研究中，由F2、F8、F11、F12菌株混合而成的復合微生物菌劑顯著降低了草莓炭疽病發病植株死亡率。不同微生物菌劑處理對土壤微生物生物量和真菌的群落結構影響不大，但顯著影響了土壤細菌的菌落結構，增加了厚壁菌門的相對豐度。選擇適宜的微生物菌劑可以作為草莓綠色防控的一種手段，進而減少農藥用量。