蛙源寡養單胞菌的分離鑒定及其生物學特性

竺利紅， 李孝輝， 施躍峰

(浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

黑斑蛙(Pelophylaxnigromaculatus)俗稱田雞、青蛙，屬蛙科側褶蛙屬的兩棲動物，因其味道鮮美、營養豐富，是有名的美味佳肴，人類對其需求量十分巨大。黑斑蛙人工養殖試驗開始于2011年，2014年可攝食靜態餌料黑斑蛙新品種育成，其養殖可實現全程投喂人工飼料，使產量迅速提高，養殖周期為5個月，每667 m2產量1 500～2 500 kg，每667 m2凈利潤可達1.5萬～5.4萬元，市場前景十分廣闊。短短幾年，養殖區域從最初的湖南省擴張至湖北、四川、江西、安徽、浙江、廣東、江蘇、重慶等地區。但是，隨著養殖規模的擴大和集約化程度的不斷提高，黑斑蛙病害頻繁發生[1-3]。2018年全國養殖黑斑蛙發病率達80%以上，死亡率達50%以上，一些嚴重的養殖池全軍覆沒，不少養殖戶選擇退出。病害問題已成為制約黑斑蛙產業化進一步發展的瓶頸，而對其相關疾病的研究少見報道[1]。寡養單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)是1993年分離出來的一個新屬，屬于黃單胞菌綱(Xanthomonadaceae)黃單胞菌目(Xanthomonadales)，目前該屬有16個不同的種[4]。本研究從人工養殖患病黑斑蛙中進行了病原菌的分離鑒定、生物學特性研究和防治藥劑篩選，旨在為從病原學角度證實蛙源寡養單胞菌的臨床感染，并為其防治提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

患病黑斑蛙于2020年6月15日從浙江某黑斑蛙養殖場采集，每只體重100～150 g。主要癥狀為行動遲緩、身體發軟、歪頭，解剖發現部分病蛙有腹水。取10只具有典型癥狀的病蛙或瀕死蛙進行病原菌分離實驗。

諾氟沙星、多黏菌素B、萬古霉素等38種抗菌藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；dNTPs(2.5 mmol·L-1)、EasyTaq酶(5 U·μL-1)、10×Easy Taq Buffer(1.2 mL)均購自北京全式金生物技術有限公司；5%脫纖綿羊血培養基購自成都萬科生物技術有限公司。聚維酮碘購自山西華坤生物科技有限公司，有效成分10%；硫酸銅、高錳酸鉀購自湖北康盛醫藥科技有限公司，分析純，有效成分99%；次氯酸購自日本株式會社；超氧水由杭州藍海科技有限公司提供。按5種滅菌劑使用說明上的有效濃度用雙蒸水配制母液，試驗時由母液稀釋成工作液。

1.2 病原菌的分離

在無菌條件下取病蛙腦組織、心臟、眼、腎臟、脾臟、肝臟、肺、腹水，劃線接種在普通營養瓊脂培養基上，37 ℃培養24～48 h。從腦組織、肝臟、肺、眼、腹水中挑取到形態一致的黃色菌落，重復劃線分離純化數次，獲得12株細菌。鑒于這12株分離菌菌落、菌體形態均相似，且16S rRNA分子鑒定為同一菌種，后續研究取1號黑斑蛙腹水中的分離株Y-13進行。

1.3 人工感染試驗

用接種環從菌株Y-13斜面蘸取少量菌苔到LB液體培養基中，37 ℃下200 r·min-1振蕩培養18 h，離心收集菌體并重懸于生理鹽水中，采用梯度稀釋法測定菌液濃度并逐級稀釋制備菌懸液。實驗組分別以5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105和5.0×104mL-1菌懸液濃度按照每只0.1 mL背部注射，每組各30只。對照組注射等量無菌生理鹽水。每天觀察其癥狀并記錄死亡數，連續觀察10 d。對瀕死黑斑蛙解剖，進行病原菌再分離。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 16S rRNA序列測定與系統發育分析

蘸取一環被檢菌斜面，接種于20 mL LB培養基的三角燒瓶中，200 r·min-137 ℃培養過夜。收集培養后的菌液，采用上海生工的Ezup柱式基因組DNA提取試劑盒提取Y-13基因組DNA，以16S rRNA通用引物進行PCR擴增，其上、下游引物的序列分別為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′。擴增體系采用25 μL的反應體系，其擴增程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增產物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后交由上海生物工程有限公司進行序列測定。測序結果與GenBank中相關核酸序列進行BLAST比對分析。選取同源性較高的序列，用MEGA 6.0軟件的Neighbor-Jioning方法構建系統進化樹。

1.4.2 培養與形態特性檢測

進行菌株的生長溫度、氧和二氧化碳需要等培養特性的測定。接種LB平板，37 ℃培養24 h后觀察細菌的生長狀況和菌落的大小、形態等，并革蘭氏和磷鎢酸染色后分別在光學顯微鏡和電子顯微鏡下觀察細菌形態特征。接種于5%脫纖綿羊血培養基中，觀察其溶血形態。

1.4.3 生理生化特性檢測

各項生化指標的測定參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行。

1.5 病原菌藥敏性研究

按K-B紙片擴散法將Y-13菌液涂布于LB瓊脂平板上，間隔一定距離貼上藥敏試紙，于37 ℃培養24 h，結果判斷依據《紙片法抗菌藥物敏感試驗操作標準》(第4版)進行。

1.6 滅菌劑MIC的測定

采用二倍稀釋法測定滅菌劑對菌株Y-13的最小抑菌濃度。根據預實驗，將各種滅菌劑依次稀釋到合適濃度，即高錳酸鉀：2 000、1 000、500、250、125、62.5 mg·L-1；硫酸銅：2 000、1 000、500、250 mg·L-1；聚維酮碘：1 000、500、250、125、62.5 mg·L-1；次氯酸：100、50、25、12.5、6.25、3.13 mg·L-1；超氧化水：100、50、25、12.5、6.25、3.13 mg·L-1。分別取濃度為107mL-1的Y-13菌液0.5 mL加入到裝有4.5 mL滅菌劑的試管中，充分混勻靜置10 min后，吸取200 μL涂布LB瓊脂平板，37 ℃下培養48 h后觀察有無菌落生長，無菌落生長的最小滅菌劑濃度即為MIC。

2 結果與分析

2.1 16S rRNA基因分析及系統發育樹構建

測序結果表明，菌株Y-13的16S rRNA基因長1 410 bp，將該序列與NCBI數據庫中相應的DNA序列進行BLAST比對，與其相似度高的菌株均屬于寡養單胞菌屬。選取相應的模式菌株序列構建系統發育樹，結果(圖1)顯示，Y-13與Stenotrophomonasterraestrain DSM 18941、Stenotrophomonashumistrain DSM 18929、Stenotrophomonasnitritireducensstrain DSM 12575聚在一起。因此,將菌株Y-13鑒定為寡養單胞菌(Stenotrophomonassp.)。

2.2 菌株的表型及生理生化鑒定

該菌株在LB平板上菌落呈圓形、光滑、濕潤、黃色。菌體呈桿狀，直徑約為0.7 mm，極生鞭毛(圖2)。該菌株與寡養單胞菌屬同一分支下的其他菌株(Stenotrophomonasterraestrain、Stenotrophomonashumi、Stenotrophomonasnitritireducens)相同，均表現為革蘭氏陰性，無芽孢，5-酮-葡萄糖苷陰性，但是又有一定的區別[5]。Y-13可在40 ℃生長，溶血性，檸檬酸鹽、明膠液化、脂酶等陰性，D-葡萄糖同化陽性(表1)。根據細菌系統進化分析及其典型的形態和生理生化特征，菌株Y-13屬于寡養單胞菌屬，鑒于其獨特的生理生化特征，推斷菌株Y-13可能是寡養單胞菌屬的一個新種。

圖1 菌株Y-13 16S rRNA基因序列系統發育樹

圖2 菌株Y-13電鏡觀察

表1 菌株Y-13與相近寡養單胞菌屬菌株的不同表型、生理生化特征

2.3 人工感染

將不同濃度的Y-13菌液背部注射到健康黑斑蛙體內，3 d后注射菌液濃度為5×108mL-1的黑斑蛙開始出現死亡，10 d后死亡率達到100%(表2)。被感染黑斑蛙起初表現為行動遲緩、食欲減退，后期出現四肢紅腫現象。有的病蛙肛門外翻出一段紅色腸管，即有脫肛現象。剖檢可見腸管及腸黏膜充血，嚴重者有出血現象(圖3)，而對照組未表現出任何不良癥狀。采用改良的寇氏法計算菌株的LD50，菌株Y-13對黑斑蛙的LD50為7.3×106mL-1。從人工感染瀕死黑斑蛙的腦脊液、眼、肝臟中均分離到大量形態、生理生化及分子特征與菌株Y-13一致的菌落，因此，認為菌株Y-13是黑斑蛙的一種病原菌。

表2 人工感染試驗結果

圖3 人工感染發病黑斑蛙的臨床病癥

2.4 藥物敏感性

從表3可以看出，在供試的38種抗生素中，菌株Y-13僅對阿莫西林、美洛西林、亞胺培南、妥布霉素、恩諾沙星、吉他霉素等11種抗生素敏感，對β-內酰胺類、大環內脂類、硝基呋喃類和多肽類抗生素均有極強的耐藥性，耐藥率達70%以上。

表3 菌株Y-13藥敏試驗結果

2.5 滅菌劑MIC的測定

幾種滅菌劑對菌株Y-13的抑菌效果見表4，可以看出超氧水和次氯酸的MIC最低，為12.5 mg·L-1，其次為高錳酸鉀和聚維酮碘(MIC=250 mg·L-1)，效果較差的是硫酸銅(MIC=1 000 mg·L-1)。

表4 幾種滅菌劑對菌株Y-13的殺滅效果

3 討論

自2014年可攝食靜態餌料的黑斑蛙新品種育成以來，短短幾年時間，黑斑蛙養殖規模迅速擴大，2019年全國養殖面積達9 000 hm2，產量約10.5萬t，產值超23.1億元。為規范管理，2020年國家正式出臺文件將黑斑蛙的人工養殖由漁業主管部門進行管理。預計未來5年內，其市場規模將達到30萬t級別。而制約黑斑蛙產業化發展的最大瓶頸是病害問題，目前已明確的黑斑蛙病原細菌主要有米爾伊麗莎白菌(Elizabethkingiamiricola)[6]、腦膜炎敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)[7]、氣單胞菌(Aeromonassp.)[3]、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)[1]等。本研究從人工養殖患病黑斑蛙中分離到1株編號為Y-13的病原菌，經鑒定歸類于寡養單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)，結合菌株的表型及生理生化鑒定結果，Y-13可能是寡養單胞菌屬的一個新種。

目前報道的寡養單胞菌屬中，嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)是唯一一類被報道的人畜共患致病菌，感染后能引起膿腫、腸炎和敗血癥等[8-13]。菌株Y-13在血瓊脂平板上出現溶血環。溶血素是細菌重要的致病因子，可引起細胞內容物外泄從而造成細胞死亡，說明本分離株毒力強。經過人工回歸試驗，發現菌株Y-13確有較強的致病性，能引起黑斑蛙腸炎、紅腿、敗血癥，其半致死濃度為7.3×106mL-1。說明除了嗜麥芽寡養單胞菌以外，寡養單胞菌屬還存在其他種類的致病菌，這是首次發現。至于本分離株的致病因子、傳染性及對人類的潛在影響等仍有待進一步研究。

根據藥敏試驗結果和水產養殖用藥規定，本研究篩選出2種治療藥物，分別是恩諾沙星和復方磺胺甲噁唑。但是在生產上，我們分別使用了這2種藥物來治療，效果均不理想，推測主要原因是患病黑斑蛙食欲降低甚至斷食，通過飼料中添加藥物的方式很難起效。因此，預防是關鍵，應加強養殖環境滅菌、降低養殖密度、提高黑斑蛙自身免疫力。本研究篩選出幾種滅菌劑的最低抑菌濃度，還需進一步考察滅菌劑不同濃度對黑斑蛙的毒性，并進一步開展大范圍的流行病學調查，深入研究蛙源病原菌的感染規律，以便指導科學用藥。