乳粉中單核細胞增生李斯特氏菌能力驗證結果與分析

樊惠華 侯磊磊 方瑩 柴梅梅

摘 要：為了提升食品檢驗檢測機構對食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢驗能力，提高微生物實驗室外部質量控制水平。本實驗室參加中國檢驗檢疫科學研究院測試評估中心組織的ACAS-PT1108（2021）乳粉中單核細胞增生李斯特氏菌檢測能力驗證，參考參試指導書、《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB 4789.30—2016）、海博單增李斯特氏菌成套生化鑒定管和MicroScan WalkAway 40 Plus全自動微生物生化鑒定儀。結果表明，參試樣品編號21-T031為單核細胞增生李斯特氏菌，樣品編號21-U887未檢出單核細胞增生李斯特氏菌，經鑒定為伊氏李斯特氏菌，最終能力驗證結果評價為滿意，可見本實驗室具有成熟的單核細胞增生李斯特氏菌檢驗能力。

關鍵詞：乳粉;單核細胞增生李斯特氏菌;能力驗證

Results and Analysis of the Proficiency Testing of Listeria Monocytogenes in Milk Powder

FAN Huihua， HOU Leilei， FANG Ying， CHAI Meimei

（Yulin Food Inspection and Testing Center， Yulin 719000， China）

Abstract： In order to improve the ability of food inspection and testing institutions to detect Listeria monocytogenes in food and to improve the external quality control level of microbiology laboratory. The laboratory participated in the proficiency testing of Listeria monocytogenes in ACAS-PT1108 （2021） milk powder organized by the Testing and Evaluation Center of the Chinese Academy of Inspection and Quarantine Sciences. Reference was made to the test guidelines， the GB 4789.30—2016， the complete biochemical identification tubes of Listeria monocytogenes in Haibo and the MicroScan WalkAway 40 Plus automatic microbial biochemical identification instrument. The results showed that the sample number 21-T031 was detected as Listeria monocytogenes， and the sample number 21-U887 was not detected as Listeria monocytogenes， which was identified as Listeria.ivanovii. The final proficiency test results were satisfactory. It can be seen that the laboratory has a mature ability to test Listeria monocytogenes.

Keywords： milk powder; Listeria monocytogenes; proficiency test

李斯特菌屬目前包括17種公認的短桿狀革蘭氏陽性菌，其中單核細胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌被認為是病原體[1]。單核細胞增生李斯特氏菌會感染人和動物，伊氏李斯特氏菌最初被認為僅感染反芻動物，GUILLET等報道伊氏李斯特氏菌可引起胃腸炎和菌血癥，被認為是一種腸道機會性病原體[2]。單核細胞增生李斯特氏菌是一種主要的食源性致病菌，可引起李斯特菌病，表現為胃腸炎、敗血癥、中樞神經系統感染以及母兒感染，導致流產、死胎、早產或患有新生兒李斯特菌病[3-4]。其廣泛存在于自然環境中，能夠在低溫、酸性pH、高鹽濃度等惡劣條件下生存，其中涼拌菜、肉及肉制品、乳與乳制品、動物性水產品等更易受到單核細胞增生李斯特氏菌的污染[5]。

能力驗證是食品檢驗檢測機構質量控制的重要手段。由于各類食品中單核細胞增生李斯特氏菌的污染報道不斷涌現，在每年的質量控制計劃中應覆蓋單核細胞增生李斯特氏菌等致病菌的比例，至少每年一次，利用能力驗證評估食品實驗室的檢驗能力。榆林市食品檢驗檢測中心因CNAS認可的需要，組織參加中國檢驗檢疫科學研究院測試評估中心組織的ACAS-PT1108（2021）乳粉中單核細胞增生李斯特氏菌檢測能力驗證。在依據國標的前提下，從樣品水化處理到全自動微生物生化鑒定儀結果分析，每個實驗環節積累經驗，保持本實驗室致病菌的檢驗檢測能力以及對即將展開的榆林市市售肉制品中單核細胞增生李斯特氏菌的污染狀況研究項目奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

實驗用的乳粉樣品由中國檢驗檢疫科學研究院測試評估中心提供，兩個樣品，編號分別為21-T031和21-U887，白色凍干塊狀，為人工污染的乳品樣品，包裝于真空西林瓶內。

1.2 培養基與試劑

李氏增菌肉湯（LB1，LB2）基礎及添加劑、李斯特氏菌顯色培養基、PALCAM瓊脂培養基、0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、革蘭氏染色試劑盒、7%羊血瓊脂基礎及脫纖維羊血及單增李斯特氏菌成套生化鑒定管等相關配套試劑，均產自青島海博生物技術有限公司;革蘭氏陽性細菌鑒定及藥敏板PC33，產自美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 儀器設備

BXM-75V立式高壓蒸汽滅菌器，上海博訊公司;BXS-250可擴展試驗箱，上海博訊公司;HFsafe 1500TE生物安全柜，上海三申公司;DM2000生物光學顯微鏡，德國徠卡公司;MicroScan WalkAway 40 Plus 全自動微生物生化鑒定儀，德國西門子公司。

1.4 標準菌株

實驗用陽性對照菌和陰性對照菌分別為單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC 19148）、斯氏李斯特氏菌（CICC 21671）、伊氏李斯特氏菌（CICC 21663）、英諾克李斯特氏菌（CICC 10417）、馬紅球菌（CICC 22955）和金黃色葡萄球菌（CICC 23656），均已完成菌株形態學鑒定和生化鑒定。

1.5 實驗方法

1.5.1 檢驗依據

根據能力驗證參試指導書對兩個樣品進行單核細胞增生李斯特氏菌定性檢驗，檢驗依據為GB 4789.30—2016第一法。同時以MicroScan WalkAway 40 Plus全自動微生物生化鑒定儀作為輔助，用來分析鑒定可疑菌株，綜合以上實驗結果進行最終報告。

1.5.2 樣品水化處理

樣品處理參考作業指導書要求進行，整個水化過程在生物安全柜內完成。本次能力驗證樣品復原后等同于60 mL的待測乳品樣品。

1.5.3 增菌

因樣品可能存在致病性，所有實驗過程在BSL-2實驗室生物安全柜內進行。依據單核細胞增生李斯特氏菌檢驗標準進行LB1和LB2增菌（兩次增菌），為保證實驗的準確性，可設計兩個平行，兩名檢驗員同時進行。對增菌結果拍照留存，同時做空白對照。

1.5.4 選擇性分離

分別用兩個培養基品牌（環凱和海博）的李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板進行劃線分離，同時用標準菌株單核細胞增生李斯特氏菌以及其他李斯特氏菌，如伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌及英諾克李斯特氏菌作為對照菌株，初步觀察菌落形態。

1.5.5 初篩

選擇上述平板上的可疑菌落，接種于木糖、鼠李糖發酵管，同時在TSA-YE平板上劃線，選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養物繼續進行鑒定。

1.5.6 形態學鑒定及生化實驗

對TSA-YE平板上的可疑單菌落分別進行染色，鏡檢，并按照海博單增李斯特氏菌成套生化鑒定管說明書進行相關實驗。同時快速用接種針挑取TSA-YE平板上培養18～24 h的單菌落，于30 mL稀釋液中，搖勻，轉移至PC33藥敏板上，隨后進行用MicroScan WalkAway 40 Plus全自動微生物生化鑒定儀鑒定。

2 結果與分析

2.1 選擇性分離

編號21-T031和21-U887的樣品經一次增菌后，因乳粉本身的干擾因素，不能判斷是否有微生物生長;二次增菌后，21-T031樣品的培養基略微渾濁，21-U887樣品的培養基呈澄清狀態，不能判斷出是否有微生物生長。將二者的LB2增菌液分別在PALCAM及李斯特顯色培養基上劃線分離，兩個樣品在兩種分離平板上至少劃線兩個以上，同時劃線單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC 19148）和其他李斯特氏菌作為對照菌。結果發現，樣品21-T031在PALCAM平板上呈現圓形、灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，無其他明顯干擾菌;在李斯特氏菌顯色平板上為藍色菌落，有不透明環，菌落形態單一。樣品21-U887在PALCAM平板上也出現少量圓形、灰綠色菌落，有棕黑色水解圈;在李斯特氏菌顯色平板上為藍色菌落，有不透明環，但很少，只集中在劃線起始位置。與陽性對照菌落形態相比，樣品21-T031和樣品21-U887均為可疑單核細胞增生李斯特氏菌，選擇性分離平板上的菌落形態見表1。

2.2 初篩及生化實驗

分別從編號21-T031和編號21-U887的選擇性分離平板上挑取5個可疑單菌落接種于木糖、鼠李糖發酵管，結果顯示，21-T031為木糖陰性、鼠李糖陽性;21-U887為木糖陽性、鼠李糖陰性。樣品21-T031和樣品21-U887表現出不一樣的反應結果。采用海博單增李斯特氏菌成套生化鑒定管對樣品21-T031和樣品21-U887進行完整的生化鑒定，鑒定結果顯示二者在木糖、鼠李糖、溶血試驗和協同溶血試驗cAMP中均有明顯的不同，與陽性對照菌相比，樣品21-T031的反應結果與單核細胞增生李斯特氏菌一致，樣品21-U887的反應結果與伊氏李斯特氏菌一致，生化鑒定結果見表2。

2.3 全自動微生物鑒定及藥敏分析系統鑒定結果

在使用海博單增李斯特氏菌成套生化鑒定管對樣品21-T031和樣品21-U887進行生化鑒定的同時，以MicroScan WalkAway 40 Plus全自動微生物鑒定及藥敏分析系統進行輔助鑒定。報告結果顯示，樣品21-T031為單核細胞增生李斯特氏菌，概率96.02%，而樣品21-U887無準確的鑒定結果，同時鑒定標準菌株，單核細胞增生李斯特氏菌鑒定結果準確，概率98.08%，而伊氏李斯特氏菌也無法準確鑒定，可能與設備數據庫菌種類別覆蓋不全面有關。鑒定結果見表3。

3 結論與討論

本次乳粉中單核細胞增生李斯特氏菌的能力驗證按照GB 4789.30—2016檢驗方法，鑒定結果發現樣品21-T031和樣品21-U887中菌種單一，無其他李斯特氏菌干擾，且樣品21-U887中添加菌種較少，在選擇性LB2增菌培養后與空白對照相比，無明顯區別，在PALCAM平板和李斯特顯色平板上分布極少，甚至出現空平板現象。因此，在實際檢測中需要多制備幾個平行，同時做陽性對照、陰性對照和空白對照。經生化鑒定，編號為21-T031檢出為單核細胞增生李斯特氏菌，編號21-U887的樣品未檢出單核細胞增生李斯特氏菌，經鑒定為伊氏李斯特氏菌。

此外，本試驗雖取得了滿意的反饋結果，但也存在耗時長，MicroScan WalkAway 40 Plus全自動生化鑒定儀數據庫覆蓋不全面等缺點。隨著檢驗技術的發展，分子生物學、色譜等技術不斷應用到李斯特氏菌檢驗中。陳學強等[6]利用BAX system Q7全自動病原微生物檢測系統、VITEK 2 COMPACT全自動細菌鑒定系統、基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和溶血素O基因（hlyA）序列比對分析、鑒定食品中單核細胞增生李斯特氏菌并取得了明顯效果。因此，可根據實驗室的需要，在食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢驗中同時輔以兩種以上的檢驗方法，互相輔助，以提升檢驗效率和結果的準確性。

通過本次能力驗證，本實驗室的單核細胞增生李斯特氏菌的檢測能力得到了驗證。能力驗證作為一種監督手段，有利于實驗室綜合能力的全面提升，也見證了中心食品檢驗檢測實驗室技術水平逐漸成熟，可更好地為榆林市人們的食品安全服務。

參考文獻

[1]ORSI R H，WIEDMANN M.Characteristics and distribution of Listeria spp.，including Listeria species newly described since 2009[J].Appl Microbiol Biotechnol，2016，100（12）：5273-5287.

[2]GUILLET C，JOIN-LAMBERT O，LE MONNIER A，et al.Human listeriosis caused by Listeria ivanovii[J].Emerging Infectious Diseases，2010，16（1）：136-138.

[3]朱靜鴻，龔云偉，武艷力.食品中單核細胞增生李斯特菌污染狀況調查[J].中國衛生工程學，2016，15（5）：491-493.

[4]王福.單核細胞增生李斯特菌研究進展[J].口岸衛生控制，2011，16（5）：50-53.

[5]東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[6]陳學強，劉陽，馬炳存，等.食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢測能力驗證[J].食品安全質量檢測學報，2018，9（19）：5080-5084.

作者簡介：樊惠華（1984—），女，陜西榆林人，碩士，工程師。研究方向：食品微生物學檢驗。