菌群預處理對高粱秸稈乙醇-甲烷聯合轉化效率的影響

曹燕篆，蘇婉，樊文華，卜玉山，劉奮武，聶督，李佳佳，崔宗均

（1.山西農業大學資源與環境學院，山西 太谷 030801；2.農業農村部環境保護科研監測所，天津 300191；3.中國農業大學農學院，北京 100193）

由于人類能源消耗的日益增加和化石燃料的不可再生性，能源短缺及燃燒過程中造成的環境污染等問題，迫使人們必須開發新能源。生物燃料具有生產原料資源豐富、可再生及環境友好等特點，近年來受到廣泛關注，如生物乙醇和生物甲烷已在世界各地實現商業化生產及應用。

生物質能是植物通過光合作用貯存在有機體中的能源，據評估，其總量約可滿足全球25%的能源需求。木質纖維素是自然界中最豐富的生物質資源，廣泛存在于高粱、玉米等農作物秸稈，可作為生產乙醇和甲烷的重要原料，其中高粱作為世界上主要的糧食作物和能源作物，因生育周期短、環境適應性強、不與主糧爭地及生物產量高等特點，被認為是生產生物燃料的潛力原料。目前，以高粱秸稈為原料生產生物燃料已有一定的探索。劉國華等以秸稈為原料發酵產乙醇，發現高粱秸稈的乙醇轉化率顯著低于水稻秸稈和小麥秸稈，歸因于其木質纖維素結構更加致密、抗酶解能力強、水解效率低。ISLAM等以高粱秸稈為原料進行兩步發酵產氫，將第一步發酵后的殘渣用1.5%（/）的稀硫酸120℃預處理1 h后再次發酵，H總產量比未處理秸稈提高了76%。可見，預處理可有效提高高粱秸稈生物燃料轉化效率。目前高粱秸稈預處理主要以物理、化學方法為主，該類方法存在能耗高、產生抑制因子及二次污染等諸多問題，嚴重限制秸稈的生物燃料轉化。與物理、化學方法相比，生物預處理具有溫和、環境友好、對發酵無抑制等優點，得到了科研人員的廣泛認可。前期研究表明構建的復合菌系MC1主要包括CSK1（45%～50%），sp.FG4（20%～30%），sp.M1-3（5%～15%），sp.M1-5（1%～5%）及sp.M1-6（10%～20%）等菌種，對水稻、玉米和大豆等農作物秸稈具有較好的降解性能。

秸稈能源轉化過程中，預處理雖可有效提高秸稈降解效率，但仍存在秸稈利用效率較低的難題。研究表明，秸稈乙醇發酵其總固體利用率僅為30%左右，如玉米秸稈經厭氧消化20 d后，其殘渣中纖維素、半纖維及木質素仍占總質量的25.1%、1.1%和21.7%。為此，有研究者提出乙醇發酵或厭氧消化后的殘渣可進一步用于生產其他生物燃料。王殿龍等利用水稻秸稈厭氧消化纖維制取乙醇，獲得87 mg·kg[以總固體（TS）計，下同]的最大乙醇產量。MOTTLE等發現小麥秸稈經厭氧發酵后既可產揮發性有機酸又能產氫，還可改善小麥秸稈的易磨性，比未經處理的小麥秸稈總物質轉化率增加131%。艾平等將纖維乙醇生產的糟液與稻稈、豬糞混合厭氧發酵，甲烷含量提高了10%。DERERIE等研究發現燕麥秸稈乙醇和甲烷聯合轉化比其直接進行厭氧消化產能提高34%。NOZARI等利用乙醇-異丙醇預處理高粱秸稈30 h，預處理后的液體用于厭氧消化生產甲烷，固體殘渣同步糖化發酵生產乙醇，其甲烷和乙醇的最大產量分別達到271.2 mL·g[以揮發性固體（VS）計，下同]及11.9 g·L。可見，乙醇-甲烷聯合轉化是提高生物質原料轉化效率及產能效率的有效途徑。

本研究以提高高粱秸稈生物降解及能量轉化效率為目的，利用木質纖維素分解菌群MC1預處理高粱秸稈，分析了不同預處理時間對秸稈降解效率的影響，比較了秸稈單產甲烷發酵和乙醇-甲烷聯產發酵的產能差異，為高粱秸稈高效轉化提供理論依據及技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

木質纖維素分解復合菌系MC1由中國農業大學農學院廢棄物資源利用研究室提供。高粱秸稈取自山西農業大學實驗站，新鮮的秸稈自然風干后粉碎至5 mm備用，厭氧發酵接種物取自山西省晉中市太谷區長期運行的戶用沼氣池，秸稈及接種物性質見表1。

表1 高粱秸稈及接種物性質Table 1 Characteristics of the sorghum straw and inoculum

復合菌系培養使用PCS培養基，配制方法為：1 L去離子水中加入蛋白胨5 g，酵母粉1 g，NaCl 5 g，CaCO2 g，自然pH。MC1活化方法：200 mL培養基內添加0.5%（/）的堿處理水稻秸稈作為碳源，121℃滅菌30 min冷卻至室溫備用。將-30℃冷凍保存的菌種解凍后接種到培養液中，置于50℃恒溫培養箱中靜置培養，秸稈明顯分解后則活化成功。

1.2 試驗設計

高粱秸稈預處理試驗：向500 mL三角瓶中加入300 mL PCS培養液，添加0.5 g濾紙條作為底物，121℃滅菌30 min后冷卻到室溫。每個三角瓶中接種10 mL活化好的MC1菌液，置于50℃靜置培養3 d，濾紙條被明顯分解后向三角瓶中添加9 g高粱秸稈（置于孔徑小于1 mm的過濾袋中）繼續培養，分別在1、3、5、7 d對MC1預處理體系取樣，命名為MT-1d、MT-3d、MT-5d及MT-7d，設置加入滅菌菌液的處理為對照（MT-CK）。每個處理重復9次，其中3次重復用于性質測定，剩余的用于燃料轉化。預處理后的秸稈殘渣經水洗烘干至恒質量，進行減量和木質纖維素成分分析，預處理液進行VFAs、sCOD等指標測定。

高粱秸稈單產甲烷發酵試驗：將MC1預處理體系和MT-CK分別轉移至1 L藍蓋瓶中，加入100 mL接種污泥，用去離子水補至發酵體積400 mL，充分混合后向瓶中充氮氣約3 min使發酵體系為厭氧條件，并立刻用膠塞封口。將發酵瓶置于（37±1）℃的恒溫培養箱中持續發酵26 d，同時設置只添加接種污泥的處理為產甲烷空白對照。發酵過程中每日測定總產氣量及甲烷含量。

高粱秸稈乙醇-甲烷聯產發酵試驗：將經MC1預處理后的高粱秸稈固體殘渣先進行同步糖化發酵產乙醇，隨后將糖化發酵的剩余殘渣與MC1預處理體系的液體部分混合，進行厭氧發酵產甲烷。其中，糖化發酵培養基使用pH 4.8檸檬酸鈉緩沖液配制，1 L培養基中含有蛋白胨5 g，NHCl 2 g，KHPO1 g，MgSO·7HO 1 g，121℃滅菌30 min。

將MC1預處理體系、MC1滅菌對照體系的秸稈殘渣加入至裝有200 mL糖化發酵培養基的三角瓶中，同時加入0.1 g·g底物的釀酒酵母和35 FPU·g底物纖維素酶（Celluclast 1.5 L，諾維信），塑料膜封口，混合均勻后置于37℃、150 r·min的恒溫搖床中糖化發酵48 h。發酵結束后，測定發酵液中乙醇含量，將剩余秸稈殘渣擠干液體后與MC1預處理液混合進行厭氧發酵產甲烷（試驗操作同高粱秸稈單產甲烷發酵試驗），厭氧發酵過程中每日測定總產氣量及甲烷含量。未經MC1預處理秸稈同步操作，作為試驗對照。

1.3 相關指標的測定

預處理秸稈殘渣經105℃烘干后稱質量，采用失重法計算秸稈質量減少量。將烘干后的固體殘渣粉碎過80目篩，準確稱取0.5 g置于F57專用袋中，用ANKOM 220型纖維分析儀測定纖維素、半纖維素及木質素含量。預處理液8 000 r·min離心10 min后，分析其上清液化學性質。酸堿度采用pH計（日本Horiba B-212）測定。VFAs濃度利用高效液相色譜儀（LC-20A，島津）測定，測定條件為伯樂Aminex HPX-87H液相色譜柱，SPD-S20A檢測器，柱溫40℃，流動相為5 mmol·LHSO，流速為0.6 mL·min，測定時間40 min。sCOD使用COD快速檢測儀（Lovibond E799718，德國）測定。乙醇含量采用美國Agilent 1260型高效液相色譜儀測定，測定條件為Bio-Rad HPX-87H柱，柱溫60℃，流動相5 mmol·L硫酸，流速0.6 mL·min。厭氧發酵產氣總量使用BMP-Test系 統（WAL-BMP-Testsystem 3150，WAL，德國）測定，通過發酵瓶內與大氣壓的絕對壓力差值計算日產沼氣量。甲烷含量使用Biogas 5000氣體分析儀（Geotech，英國）測定。

1.4 產甲烷動力學分析

試驗采用改進的動力學模型Modified Gompertz方程對厭氧發酵參數進行擬合，模型參數推導過程詳見文獻[23-24]，公式為：

式中：為時刻的累積產甲烷量，mL·gVS；為最大產甲烷潛能，mL·gVS；為最大產甲烷速率，mL·g·d；λ為延滯期，d；為發酵時間，d；e為常數2.718。，和λ為批次厭氧發酵試驗數據擬合獲得。

1.5 產能分析

對高粱秸稈生物質能轉化進行能量輸出分析，計算公式如下：

式中：為標準狀態下甲烷的熱值，55.64 kJ·g；為標準狀態下乙醇的熱值，29.71 kJ·g；為厭氧發酵產生的甲烷體積，mL·gVS；為甲烷的密度，0.72 g·L；為秸稈殘渣生產的乙醇總量，g·kgVS。

1.6 數據處理

試驗數據處理及分析使用軟件Excel 2010，SPSS 20及Origin 9.1。方差分析使用Duncan多范圍檢驗，＜0.05時為差異顯著。

2 結果與討論

2.1 預處理過程中秸稈質量損失

由圖1可知，高粱秸稈預處理7 d后質量損失率達到40.08%，其中纖維素、半纖維素及木質素的質量損失率分別為27.39%、39.48%及15.55%。復合菌系MC1對秸稈的降解主要發生在預處理初期，3 d時總質量損失達到36.52%，纖維素、半纖維素及木質素3 d的質量損失量分別占其總質量損失的81.49%、78.85%及67.85%。該結果與已有報道相近，潘云霞等利用復合菌系預處理稻稈，3 d時降解率達到64.05%，降解作用同樣發生在預處理初期。預處理過程中菌群對半纖維素的降解能力優于木質素和纖維素，這與半纖維素主要由木聚糖、阿拉伯木聚糖等易降解的糖類組成有關。微生物菌群MC1對高粱秸稈木質纖維素致密結構的有效破壞，是提高秸稈水解效率及生物燃料轉化率的有效保障。

圖1 高粱秸稈預處理過程中的質量損失Figure 1 Weight loss of sorghumstraw during pretreatment

2.2 預處理液的性質

在整個預處理過程中，預處理液pH呈先下降后上升的趨勢。從圖2A中可以看出，預處理1 d，pH由初始的7.79迅速下降至5.13，sCOD濃度從4.02 g·L升高到7.83 g·L，隨后pH穩定在6.60左右。sCOD濃度在第5 d達到最高（8.10 g·L），隨后呈現下降趨勢。

預處理水解液中VFAs濃度的快速積累是增加木質纖維素原料甲烷產量的重要因素，VFAs總量在預處理第5 d達到最高，為2.92 g·L（圖2B）。整個預處理過程中，VFAs以乙酸和丁酸為主，占總VFAs的92.05%～95.04%，且均在第5 d濃度達到最高，分別為1.54 g·L及1.17 g·L。產甲烷過程中，乙酸可以直接被乙酸營養型甲烷菌代謝轉化為甲烷，丁酸可被產氫產乙酸菌利用轉化為乙酸，進而在甲烷菌的作用下轉化為甲烷。預處理液中乙酸和丁酸的大量產生，為促進高粱秸稈甲烷轉化提供可能。此外，高濃度丙酸對產甲烷過程有明顯的抑制作用，MC1預處理過程中丙酸始終維持在較低水平，有利于維持厭氧發酵體系的穩定性。

圖2 高粱秸稈預處理過程中水解液pH、sCOD及VFAs的變化Figure 2 Changes of pH，sCODand VFAs in hydrolysate during sorghumstraw pretreatment

2.3 預處理對高粱秸稈產乙醇的影響

高粱秸稈同步糖化發酵產乙醇結果如圖3所示。經48 h發酵，未處理秸稈MT-CK產乙醇量為28.92 g·kgVS，顯著低于處理組（＜0.05）。秸稈經MC1預處理后，乙醇產量提高85.21%～173.78%，其中MT-5d產乙醇量最高，為79.18 g·kgVS；MT-1d、MT-5d和MT-7d同步糖化發酵乙醇產量無顯著差異。乙醇發酵過程中，纖維素在纖維素酶的作用下轉化為單糖，隨后酵母菌通過糖酵解過程將葡萄糖轉化為丙酮酸。可見，纖維素酶解效率是決定乙醇產量的關鍵因素。MC1預處理能有效降解秸稈木質纖維素各組分（圖1），通過破壞木質纖維素結構以增加纖維素酶與纖維素的接觸，進而提高纖維素酶解效率及乙醇產量。

圖3 高粱秸稈預處理殘渣乙醇產量Figure 3 Ethanol yield of sorghumstraw residues pretreated by MC1

2.4 預處理及聯合發酵對高粱秸稈產甲烷的影響

圖4 A～圖C為高粱秸稈厭氧發酵產氣特征，發酵原料為秸稈預處理液與乙醇發酵剩余固體殘渣的混合物。預處理液中含有高濃度的VFAs，能夠快速啟動厭氧發酵。日產沼氣量在發酵最初幾天迅速增加，達到峰值后開始下降，其中MT-5d在厭氧發酵第3 d達到產氣高峰48.39 mL·gVS（圖4A）。MT-5d的累積產沼氣量最高，比MT-CK提高了52.08%（圖4B）。在整個厭氧發酵過程中，日產甲烷量有兩個高峰階段，第一個高峰出現在發酵第5 d左右，第二個高峰出現在15 d左右（圖4C）。秸稈經預處理后甲烷累積產量均比MT-CK高，產量由高至低順序為MT-5d＞MT-7d＞MT-1d＞MT-3d，比MT-CK提高了94.31%～138.73%。

高粱秸稈單產甲烷發酵與乙醇-甲烷聯產發酵下累積產甲烷量如圖4D所示。結果表明，預處理能顯著提高高粱秸稈甲烷產量，且乙醇-甲烷聯產發酵的甲烷產量比單產甲烷發酵提高了8.95%～32.55%；其中MT-5d累積甲烷產量為239.50 mL·gVS，顯著高于其他處理（＜0.05）。但MT-CK結果相反，因乙醇發酵過程中纖維素等物質的消耗導致厭氧發酵可用底物的減少，秸稈乙醇-甲烷聯合發酵產甲烷量顯著低于單發酵甲烷產量（＜0.05）。

圖4 高粱秸稈厭氧發酵產氣結果Figure 4 Biogas production during anerobic fermentation of sorghumstraw

利用木質纖維素分解菌預處理秸稈以提高甲烷產量，已被很多研究報道。THEURETZBACHER等用CBS5774預處理小麥秸稈42 d后，甲烷產量顯著提高了15%。ZHAO等以玉米秸稈為原料經復合菌系預處理后，甲烷產量提高了62.85%。菌群預處理之所以能提高甲烷產量，一是預處理破壞了木質纖維素結構，增加了酶對纖維素的降解能力；二是菌群提高了水解液中VFAs濃度，增強了厭氧發酵體系菌群捕獲乙酸和還原二氧化碳產甲烷的能力。此外，乙醇已被證實能夠提高厭氧發酵過程中微生物種間直接電子傳遞（DIET）。據報道，厭氧消化體系中加入含有10%～20%乙醇的有機物料，能夠提高體系對高有機負荷的耐受，減少丁酸、丙酸等有機酸的積累，甲烷轉化率可提高至85%以上。因此，高粱秸稈乙醇-甲烷聯產發酵甲烷產量的提高可能與以下幾個因素有關，一是預處理水解液有機酸濃度的提高，二是乙醇發酵過程進一步破壞了秸稈殘渣木質纖維素結構，增加了水解酶對殘渣纖維素等大分子的可及性，三是秸稈殘渣中殘留的少量乙醇進入厭氧發酵體系，提高了厭氧發酵體系DIET，進而提高產甲烷效率。

2.5 產甲烷動力學分析

高粱秸稈乙醇-甲烷聯產發酵產甲烷過程動力學特性如表2所示。Modified Gompertz模型能較好地反映不同時間預處理組產甲烷過程（為0.996～0.998），其中，和與試驗值基本吻合。秸稈預處理時間為5 d時值最高，最大產甲烷速率可達13.96 mL·g·dVS，與MT-CK相比提高了144.06%，且所有預處理均提高了甲烷產量。λ值隨著預處理時間的增加呈現先增加后降低的變化趨勢。

表2 不同預處理時間高粱秸稈產甲烷動力學參數Table 2 Kinetic parameters of methane production from sorghum straw at different pretreated times

2.6 預處理和聯合發酵對高粱秸稈生物轉化產能的影響

高粱秸稈經MC1預處理后進行生物轉化的產能分析如圖5所示。未處理秸稈乙醇-甲烷聯產總產能為4 878.15 kJ·kgVS，比單產甲烷產能提高了8.21%。復合菌系預處理有效提高了秸稈乙醇及甲烷產量，秸稈經MC1預處理后單產甲烷產能比MTCK提高了44.42%～73.11%，乙醇-甲烷聯產總產能比單產甲烷產能提高了38.31%～65.06%，其中MT-5d聯合發酵總產能最高，為11 947.04 kJ·kgVS，比未處理秸稈單產甲烷產能提高了165.02%。

圖5 高粱秸稈單產甲烷及乙醇-甲烷聯產產能分析Figure 5 The energy output from methane fermentation（only）as well as from a combined ethanol and methane fermentation of sorghum straw

在燃料生產中，乙醇-甲烷聯產被認為是很有前景的一種生物質能源轉化措施。THEURETZBACHER等研究發現生物及高溫蒸汽預處理后小麥秸稈乙醇-甲烷聯產產能達10.86 MJ·kgVS，比未處理秸稈單產甲烷產能提高了44%；DERERIE等的研究結果也證實了燕麥秸稈乙醇-甲烷聯產比單產甲烷產能提高28%～34%。WU等以狼尾草為原料證實了乙醇、甲烷聯產能夠有效提高物料轉化效率和能量產出。雖然秸稈乙醇-甲烷聯產能有效提高產能，但在實際應用中需進一步考慮生產乙醇的經濟投入。

3 結論

（1）菌群MC1能有效降解秸稈并破壞木質纖維素結構，預處理7 d秸稈質量損失率達40.08%；且預處理5 d秸稈水解效果最好，其水解液可溶性化學需氧量和揮發性有機酸含量達到最高。

（2）MC1預處理及乙醇-甲烷聯合轉化可有效提高高粱秸稈生物轉化效率，預處理5 d獲得了乙醇和甲烷最高產量，分別為79.18 g·kgVS和239.50 mL·gVS，總產能達到最高，為11 947.04 kJ·kgVS，比未處理秸稈單產甲烷產能提高了165.02%。可見，MC1預處理高粱秸稈后進行乙醇-甲烷聯產能顯著增加秸稈乙醇、甲烷累積產量，提高木質纖維素利用率和能量回收率，實現高粱秸稈生物質能的高效轉化。