跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)通過(guò)抑制骨吸收CN/NFATc1信號(hào)通路改善慢性腎病小鼠骨代謝和骨結(jié)構(gòu)

馬 濤

2017年，改善全球腎臟病預(yù)后組織（Kidney Disease：Improving Global Outcomes，KDIGO）更新發(fā)布了慢性腎臟病礦物質(zhì)和骨代謝紊亂的診斷、評(píng)估、預(yù)防和治療指南，該指南指出慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）在全球普通成年人中的患病率很高（＞10%）（Ketteler et al.，2017），除了與心血管疾病的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)外，CKD還可導(dǎo)致骨礦物質(zhì)代謝紊亂繼而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松（Hruska et al.，2017）。臨床治療骨質(zhì)疏松癥常用的藥物是抗分解代謝藥物，如甲狀旁腺激素為基礎(chǔ)的骨合成代謝藥物（Bover et al.，2016），但使用該藥物治療CKD患者的骨質(zhì)疏松癥存在爭(zhēng)議，因?yàn)镃KD患者本身就存在甲狀旁腺功能亢進(jìn)問(wèn)題，再使用該藥物無(wú)疑會(huì)大大增加CKD患者心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)（Pontes et al.，2018）。骨細(xì)胞作為機(jī)械感受器，在受到運(yùn)動(dòng)或機(jī)械刺激時(shí)可以促發(fā)骨重建。有研究（Watson et al.，2019）證實(shí)，運(yùn)動(dòng)可以提高骨量和骨強(qiáng)度，積極的體力活動(dòng)可降低骨吸收和促進(jìn)骨形成。那么，能否通過(guò)運(yùn)動(dòng)改善CKD患者的骨重建，從而防治CKD患者骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生？此外，CN/NFATc1信號(hào)通路已被證實(shí)為破骨細(xì)胞生成和骨吸收的主要信號(hào)通路之一，且其在CKD導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松中扮演了重要角色（Ma et al.，2019）。那么，運(yùn)動(dòng)能否通過(guò)CN/NFATc1信號(hào)通路改變CKD患者的骨重建以防治骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生？目前鮮見(jiàn)此方面的研究。本研究通過(guò)腎部分切除兩步法誘導(dǎo)CKD模型小鼠，研究跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)是否通過(guò)CN/NFATc1信號(hào)通路抑制CKD小鼠骨吸收，從而改善CKD模型小鼠骨密度和骨結(jié)構(gòu)。

1 研究材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及分組

30只4周齡C57BL/6雄性小鼠，購(gòu)于上海西普爾-必凱公司［生產(chǎn)證號(hào)：SYXX（滬）2015-0011］，在溫度（22±1）℃的恒溫動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，光照條件遵守12∶12小時(shí)明暗交替規(guī)律，普通嚙齒類動(dòng)物飼料購(gòu)于上海斯萊克公司（含0.95%鈣和1.07%磷酸鹽），整個(gè)研究過(guò)程中動(dòng)物隨意飲水、進(jìn)食。

將小鼠隨機(jī)分為CKD組和假手術(shù)對(duì)照組（SHAM）。參照Liao等（2019）的造模方法，采用腎部分切除兩步法誘導(dǎo)CKD模型，具體操作步驟：小鼠購(gòu)回適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，麻醉小鼠，切除1/3右腎，1周后，切除整個(gè)左腎。造模成功后，CKD模型小鼠被隨機(jī)分為CKD對(duì)照組（CKD）和CKD運(yùn)動(dòng)組（CKD＋E）。假手術(shù)對(duì)照組小鼠只進(jìn)行造模手術(shù)中切除腎臟之前的步驟，不切除腎臟。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物訓(xùn)練方案

CKD＋E組小鼠在手術(shù)后第3天開(kāi)始跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，跑臺(tái)型號(hào)為段式跑臺(tái)ZH-PT，具體參照Liao等（2019）的運(yùn)動(dòng)方案：第1周跑臺(tái)速度為9 m/min，每天訓(xùn)練10 min；第2周跑臺(tái)速度為12 m/min，每天訓(xùn)練1 h；從第3周開(kāi)始，跑臺(tái)速度固定為16 m/min，每天訓(xùn)練1 h；共計(jì)訓(xùn)練8周。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材

在末次訓(xùn)練24 h后，對(duì)CKD＋E組小鼠眼球摘除取血，將血液收集于1.5 mL離心管中，1 000 rpm離心10 min，取血清保存于-80℃冰箱中待測(cè)；取小鼠左右兩側(cè)股骨、脛骨和腰椎骨，將肌肉、軟組織等去除干凈，待測(cè)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 Micro-CT法檢測(cè)股骨和第三腰椎骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)

將小鼠左側(cè)股骨和腰椎骨用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定24 h后，利用微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（micro computed tomography，Micro-CT）檢測(cè)股骨近端和第三腰椎骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)（Micro-CT儀器型號(hào)：Bruker SkyScan 1278，德國(guó)），并利用CT An軟件對(duì)松/皮質(zhì)骨骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析。

1.4.2 ELISA法測(cè)試血清骨代謝指標(biāo)

取血清，酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清骨代謝標(biāo)志物（ELISA試劑盒購(gòu)自SIGMA），骨形成標(biāo)志物：血清骨鈣素（osteocalcin，OC）、血清骨堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）、血清I型原膠原C端前肽（procollagen type I C propeptide，PICP）、血清I型原膠原N端前肽（procollagen type I N propeptide，PINP）；骨吸收標(biāo)志物：血清I型膠原交聯(lián)C-末端肽（C-terminal crosslinking telopeptide of type I collagen，CTX）、血清I型膠原交聯(lián)N-末端肽（N-terminal crosslinking telopeptide of type I collagen，NTX）、血清抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRACP）。

1.4.3 Quantitative Real-time PCR法測(cè)定股骨中CN/NFATc1信號(hào)通路相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)

參照馬濤（2012）的步驟提取右側(cè)股骨中RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA（試劑盒購(gòu)自Takara Bio）。按實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（試劑盒購(gòu)自Takara Bio）步驟對(duì)股骨中骨吸收相關(guān)因子的mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。利用Primer Premer引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物序列（表1）設(shè)計(jì)，引物的合成由上海生工生物工程有限公司完成。

表1 引物序列Table 1 List of Primer Sequence

1.4.4 Western Blot檢測(cè)骨中Src1和NFATc1的蛋白表達(dá)

參照馬濤（2012）的步驟提取左側(cè)股骨和兩側(cè)脛骨中蛋白，BCA法測(cè)定濃度、蛋白變性、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別用I抗4℃和Ⅱ抗室溫孵育，所需抗體為β-actin一抗（兔抗鼠，Santa Cruz）、Src1和 NFATc1一抗（兔抗鼠，Santa Cruz）、Odyssey熒光二抗（山羊抗兔，Odessey）。洗膜后，Odyssey熒光凝膠成像系統(tǒng)（eBioscience）掃描、拍照，并用Odyssey凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以待測(cè)蛋白與內(nèi)參蛋白的平均密度之比作為待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各檢測(cè)結(jié)果以M±S表示，SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用多因素方差分析（MANOVA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，如果發(fā)現(xiàn)有顯著性差異，組間采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05差異顯著性，P＜0.01差異非常顯著性。

2 結(jié)果

2.1 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)

2.1.1 股骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)

SHAM組小鼠股骨近端松質(zhì)骨骨小梁三維空間結(jié)構(gòu)良好，骨小梁排列有序且致密，骨小梁間隙較?。慌cSHAM組相比，CKD組小鼠股骨近端松質(zhì)骨骨小梁三維空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，骨小梁排列凌亂且疏松，骨小梁間隙較大；CKD＋E組小鼠股骨近端松質(zhì)骨骨小梁三維空間結(jié)構(gòu)優(yōu)于CKD組，但與SHAM組仍存在一定差異（圖1，圖2）。數(shù)據(jù)顯示，與SHAM組相比，CKD組小鼠股骨近端松質(zhì)骨骨體積（BV）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、橫斷面積（IS）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨密度（BMD）均顯著降低（P＜0.01），骨小梁分離度（Tb.Sp）和總孔隙度［Po（tot）］顯著升高（P＜0.01）；與CKD組相比，CKD＋E組小鼠股骨近端松質(zhì)骨BV、BV/TV、IS、Tb.Th、Tb.N和BMD顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），Tb.Sp和Po（tot）顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與SHAM組相比，CKD＋E組小鼠股骨近端松質(zhì)骨BV/TV、Tb.Th、Tb.N和BMD顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），Po（tot）顯著升高（P＜0.05）（表 2）。各組小鼠股骨皮質(zhì)骨各指標(biāo)未見(jiàn)顯著性差異（P＞0.05，表3）。

表2 各組小鼠股骨近端松質(zhì)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)Table 2 Histomorphometric Indexes of Cancellous Bone in Proximal Femur of Mice in Each Group

表3 各組小鼠股骨皮質(zhì)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)Table 3 Histomorphometric Indexes of Femur Cortex of Mice in Each Group

圖1 各組小鼠股骨Micro-CT掃描部位示意圖（40×）Figure 1. Micro CT Scanning Site of Femur of Mice in Each Group（40×）

圖2 各組小鼠股骨近段松質(zhì)骨Micro-CT掃描結(jié)果（100×）Figure 2. Micro CT Scanning Results of Cancellous Bone in the Proximal Femur of Mice in Each Group（100×）

2.1.2 腰椎骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)

SHAM組小鼠第三腰椎松質(zhì)骨骨小梁三維空間結(jié)構(gòu)良好，骨小梁排列有序且致密，骨小梁間隙較小；與SHAM組相比，CKD組小鼠第三腰椎松質(zhì)骨骨小梁三維空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，骨小梁排列凌亂且疏松，骨小梁間隙較大；CKD＋E組小鼠第三腰椎松質(zhì)骨骨小梁三維空間結(jié)構(gòu)優(yōu)于CKD組，但與SHAM組仍存在一定差異（圖3，圖4）。數(shù)據(jù)顯示，與SHAM組相比，CKD組小鼠第三腰椎松質(zhì)骨BV、BV/TV、IS、Tb.Th、Tb.N和BMD顯著降低（P＜0.01），Tb.Sp和 Po（tot）顯著升高（P＜0.01）；與 CKD組相比，CKD＋E組小鼠第三腰椎松質(zhì)骨BV、BV/TV、IS、Tb.Th、Tb.N和BMD顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），Tb.Sp和Po（tot）顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與SHAM組相比，CKD＋E組小鼠第三腰椎松質(zhì)骨BV、BV/TV和Tb.N顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），Po（tot）顯著升高（P＜0.05），其他指標(biāo)未見(jiàn)顯著變化（P＞0.05；表4）。

表4 各組小鼠第三腰椎松質(zhì)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)Table 4 Histomorphometric Indexes of Cancellous Bone in the Third Lumbar Vertebrae of Mice in Each Group

圖3 各組小鼠腰椎骨Micro-CT掃描部位示意圖（40×）Figure 3. Micro CT Scanning Site of Lumbar Vertebrae in Each Group（40×）

圖4 各組小鼠第三腰椎松質(zhì)骨Micro-CT掃描結(jié)果（100×）Figure 4. Micro CT Scanning Results of the Cancellous Bone of the Third Lumbar vertebrae in Each Group（100×）

2.2 血清骨代謝指標(biāo)

與SHAM組相比，CKD組小鼠血清骨形成指標(biāo)OC、PICP、PINP和BALP顯著降低（P＜0.01），血清骨吸收指標(biāo)CTX、NTX和TRACP顯著升高（P＜0.01）；與CKD組相比，CKD＋E組OC、PICP、PINP和BALP顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），CTX、NTX和TRACP顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與SHAM組相比，CKD＋E組小鼠PICP顯著降低（P＜0.05），CTX、NTX和TRACP顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），其他指標(biāo)未見(jiàn)顯著變化（P＞0.05；表5）。

表5 各組小鼠血清骨代謝指標(biāo)Table 5 Serum Bone Metabolism Indexes of Mice in Each Group

2.3 股骨中CN/NFATc1相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)

與SHAM組相比，CKD組小鼠股骨骨吸收相關(guān)因子TRAF6、Src1、PLC、CN、NFATc1和 TRAP顯著升高（P＜0.01），而Src3未見(jiàn)顯著變化（P＞0.05）；與CKD組相比，CKD＋E組TRAF6、Src1、PLC、CN、NFATc1和TRAP顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），Src3沒(méi)有顯著變化（P＞0.05）；與SHAM組相比，CKD＋E組PLC、NFATc1和TRAP顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），其他指標(biāo)未見(jiàn)顯著變化（P＞0.05；表6）。

表6 股骨中骨吸收相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)Table 6 mRNAExpression of Bone Resorption Related Cytokines in Femur

2.4 骨組織中Src1和NFATc1的蛋白表達(dá)

與SHAM組相比，CKD組小鼠骨組織中Src1和NFATc1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與CKD組相比，CKD＋E組顯著降低（P＜0.01）；與SHAM組相比，CKD＋E組顯著升高（P＜0.05或P＜0.01；表7，圖5）。

表7 骨組織中Src1和NFATc1的蛋白表達(dá)Table 7 Protein Expression of Src1 and NFATc1 in Bone Tissue

圖5 骨組織中Src1和NFATc1的蛋白表達(dá)Figure 5. Protein Expression of Src1 and NFATc1 in Bone Tissue

3 分析與討論

3.1 CKD對(duì)小鼠骨結(jié)構(gòu)和骨代謝的影響

骨是一種礦物質(zhì)儲(chǔ)存庫(kù)，有助于維持血清鈣和磷酸鹽的穩(wěn)態(tài)（Roschger et al.，2019）。當(dāng)腎功能惡化時(shí)，骨-甲狀旁腺-腎軸被破壞，隨后發(fā)生各種礦物質(zhì)和激素紊亂（Wang et al.，2019）。CKD導(dǎo)致的礦物質(zhì)骨紊亂主要表現(xiàn)在甲狀旁腺激素、維生素D、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23（FGF-23）、鈣和磷酸鹽水平以及骨轉(zhuǎn)換的代謝紊亂，這些電解質(zhì)、激素和骨代謝之間的代謝紊亂不僅導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，而且還增加了血管鈣化的風(fēng)險(xiǎn)，骨和礦物質(zhì)電解質(zhì)代謝紊亂以及心血管并發(fā)癥增加CKD患者的死亡率（Jin et al.，2018）。本研究中，與SHAM組相比，CKD組小鼠股骨近端松質(zhì)骨和第三腰椎松質(zhì)骨骨小梁三維空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，骨小梁排列凌亂且疏松，骨小梁間隙較大，BV、BV/TV、IS、Tb.Th、Tb.N和BMD顯著降低而Tb.Sp和Po（tot）顯著升高，說(shuō)明采取的腎部分切除兩步法成功誘導(dǎo)CKD模型小鼠。血清骨代謝指標(biāo)顯示，與SHAM組相比，CKD組小鼠血清骨形成指標(biāo)OC、PICP、PINP和BALP顯著降低而血清骨吸收指標(biāo)CTX、NTX和TRACP顯著升高，進(jìn)一步證明CKD小鼠骨代謝的失衡，骨形成和骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，骨吸收大于骨形成，從而造成骨質(zhì)疏松。

值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)中CKD對(duì)小鼠骨質(zhì)的影響僅表現(xiàn)在血清骨代謝指標(biāo)和松質(zhì)骨方面，皮質(zhì)骨方面表現(xiàn)并不明顯。與SHAM組相比，CKD組小鼠股骨皮質(zhì)骨各指標(biāo)未見(jiàn)顯著性改變。提示，本實(shí)驗(yàn)可能是因?yàn)槭中g(shù)造模之后的時(shí)間不夠長(zhǎng)，CKD對(duì)骨質(zhì)的損害還未能在皮質(zhì)骨方面顯示出來(lái)。近年研究顯示，CKD對(duì)骨質(zhì)的影響是逐步深入的過(guò)程，腎功能障礙對(duì)骨質(zhì)的影響最初可能僅表現(xiàn)在代謝指標(biāo)方面，隨著病情的延長(zhǎng)，松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)開(kāi)始出現(xiàn)變化，如果病情時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)才會(huì)出現(xiàn)改變（Donderski et al.，2017；Massy et al.，2017）。

3.2 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)CKD小鼠骨結(jié)構(gòu)和骨代謝的影響

據(jù)報(bào)道，運(yùn)動(dòng)可以改善老年和絕經(jīng)后女性的骨質(zhì)疏松癥（Chan et al.，2018；Yuan et al.，2016）。然而，CKD 患者表現(xiàn)為慢性代謝功能障礙，是特殊人群，運(yùn)動(dòng)改善老年和絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥的研究結(jié)論并不能直接推論至CKD患者（Bellasi et al.，2018）。在臨床實(shí)踐中，醫(yī)生由于擔(dān)心運(yùn)動(dòng)可能會(huì)加重CKD患者的負(fù)擔(dān)，所以對(duì)CKD患者的運(yùn)動(dòng)干預(yù)措施通常采取保守態(tài)度（Hiraki et al.，2017；Watson et al.，2020）。然而，《KDIGO 臨床實(shí)踐指南：慢性腎臟病患者的血壓管理》建議CKD患者應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)捏w力活動(dòng)（Levin et al.，2014）。對(duì)透析前CKD患者進(jìn)行的幾項(xiàng)運(yùn)動(dòng)研究表明，至少在輕度CKD患者中，運(yùn)動(dòng)是安全的（Heiwe et al.，2011；Johansen et al.，2012），運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為對(duì)CKD患者的血管健康有益（Deligiannis et al.，1999；Van Craenenbroeck et al.，2014）。

關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)CKD患者骨質(zhì)疏松影響的研究很有限。本研究通過(guò)腎部分切除兩步法誘導(dǎo)建立CKD模型小鼠，在對(duì)CKD模型小鼠進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練時(shí)，考慮到動(dòng)物手術(shù)后恢復(fù)期的身體狀況以及動(dòng)物對(duì)跑臺(tái)訓(xùn)練的適應(yīng)過(guò)程，參照Liao等（2019）采取逐步增加運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)時(shí)間的訓(xùn)練方案。事實(shí)證明，這種循序漸進(jìn)的運(yùn)動(dòng)方法是安全可靠的，在訓(xùn)練和飼養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有動(dòng)物受傷或死亡。結(jié)果顯示，與CKD組相比，CKD＋E組小鼠股骨近端松質(zhì)和第三腰椎松質(zhì)骨骨小梁三維空間結(jié)構(gòu)得到優(yōu)化，骨小梁排列有序且緊密，骨小梁間隙變小，BV、BV/TV、IS、Tb.Th、Tb.N和BMD顯著升高而Tb.Sp和Po（tot）顯著降低，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)能夠改善CKD小鼠的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)，使CKD對(duì)骨結(jié)構(gòu)的破壞得到恢復(fù)。血清骨代謝指標(biāo)也顯示，與CKD組相比，CKD＋E組小鼠血清骨形成指標(biāo)OC、PICP、PINP和BALP顯著升高而血清骨吸收指標(biāo)CTX、NTX和TRACP顯著降低，進(jìn)一步證明了運(yùn)動(dòng)可以改善CKD小鼠骨代謝失衡，使骨形成和骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡得到恢復(fù)，并最終使骨密度和骨結(jié)構(gòu)得到改善。

值得注意的是，由于人與小鼠在對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激和機(jī)體適應(yīng)方面存在差異，本研究所采用的較大運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度是否也適用于人體和CKD患者仍需更多的實(shí)證研究進(jìn)行驗(yàn)證。

3.3 CN/NFATc1信號(hào)通路在跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)抑制CKD小鼠骨吸收中的作用

CN/NFATc1信號(hào)通路是破骨細(xì)胞分化的主要信號(hào)通路之一（Yang et al.，2019），其上游細(xì)胞因子核因子κB受體激活因子配體（RANKL）與核因子κB受體激活因子（RANK）結(jié)合后，將信號(hào)傳遞給鏈接蛋白腫瘤壞死因子受體（TNFRs）家族，繼而激活其下游一系列信號(hào)通路，包括NF-κB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、CN/NFATc1信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路和蛋白激酶C信號(hào)通路等（Li et al.，2019；Wang et al.，2018）。其中，CN/NFATc1信號(hào)通路是經(jīng)腫瘤壞死因子受體TNFR6激活的重要通路，活化T細(xì)胞核因子（NFAT）是一種鈣離子調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄因子，包括NFAT1～4，被鈣調(diào)磷酸酶（CN）活化后，快速轉(zhuǎn)為進(jìn)入細(xì)胞核并與相應(yīng)啟動(dòng)子結(jié)合啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄（Li et al.，2017）。將CN和NFATc1特異性阻斷后，單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)將不能分化為破骨細(xì)胞（Zeng et al.，2017）。有實(shí)驗(yàn)證明，在沒(méi)有RANKL存在的情況下單獨(dú)激活NFATc1，可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，單獨(dú)激活A(yù)P-1或NF-κB則無(wú)法誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化（Xu et al.，2016）。因此，CN/NFATc1可能是破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵性通路。CN/NFATc1兩條信號(hào)通路可以簡(jiǎn)單表示為：RANKL＋RANK→TRAF6→Src→PLC→IP3→Ca2＋→CN→NFATc1→促進(jìn)破骨細(xì)胞分化；RANKL＋RANK→TRAF6→Src→PLC→PI3K→Akt抑制GSK-3→NFATc1活化→促進(jìn)破骨細(xì)胞分化（Shen et al.，2015）。

本研究中，通過(guò)熒光定量PCR的方法測(cè)試小鼠股骨中CN/NFATc1信號(hào)通路相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，與SHAM組相比，CKD組小鼠股骨CN/NFATc1信號(hào)通路相關(guān)因子TRAF6、Src1、PLC、CN、NFATc1和TRAP顯著升高；與CKD組相比，CKD＋E組小鼠股骨骨吸收相關(guān)因子TRAF6、Src1、PLC、CN、NFATc1和 TRAP顯著降低。說(shuō)明CKD可以通過(guò)上調(diào)CN/NFATc1信號(hào)通路相關(guān)因子的基因表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成和活化，使骨吸收大于骨形成，從而破壞骨密度和骨結(jié)構(gòu)，而運(yùn)動(dòng)則可以抑制CN/NFATc1信號(hào)通路相關(guān)因子的基因表達(dá)，改善骨代謝，降低CKD造成的骨質(zhì)損害。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與SHAM組相比，CKD組小鼠脛骨中Src1和NFATc1蛋白表達(dá)顯著升高；與CKD組相比，CKD＋E組顯著降低，進(jìn)一步從蛋白水平上揭示了CN/NFATc1信號(hào)通路在CKD骨損害中的作用，以及運(yùn)動(dòng)通過(guò)CN/NFATc1信號(hào)通路抑制CKD小鼠的骨吸收。值得注意的是，在本研究中各組之間Src3的mRAN表達(dá)未見(jiàn)顯著差異，提示，Src3在CKD引起的骨損害以及運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)CKD骨代謝過(guò)程中未發(fā)揮主要作用。

4 結(jié)論

CKD對(duì)小鼠松質(zhì)骨骨密度和骨結(jié)構(gòu)的影響大于皮質(zhì)骨；跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可改善CKD小鼠的骨代謝，提高其骨密度和骨結(jié)構(gòu)；跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)通過(guò)抑制骨吸收CN/NFATc1信號(hào)通路改善CKD小鼠骨代謝和骨結(jié)構(gòu)。