基于宏基因組學技術的炎癥性腸病小鼠的運動干預研究

胡雙雙 ，俞 益 ，董靜梅 *

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種高發的慢性疾病，被稱為不是癌癥的“癌癥”（Backhed et al.，2005），表現為長期復發性炎癥細胞浸潤腸壁，患者反復發生腹痛、腹瀉、黏液血便，甚至出現各種全身并發癥，因而導致該病的治療療程長達數年，甚至需要終身服藥。近20年來，因飲食習慣改變和環境因素影響，我國炎癥性腸病患者的數量呈進行性增加，近5年的病例數是20世紀90年代同期的8倍（Dolan et al.，2017）。這種疾病高發于青壯年時期，在患病30年后發展為結直腸癌的風險高達18%。因此，鑒于該病在我國的高發性、反復性和誘癌性特點，其藥物治療又存在周期長、潛在副作用多和療效顯著性差等醫學難點，IBD的預防與替代治療成為國內外探究的熱點。已有研究證明，適度運動在腸道免疫和腸道微生態的調控上具有良好作用（Cook et al.，2013；Saxena et al.，2012）。基于此，本研究通過建立小鼠的IBD模型，利用高通量測序和宏基因組學測序技術，探索與IBD腸道相關聯的腸道功能性優勢微生物群落。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

無特異病原體（specific pathogen free，SPF）清潔級4～6周齡的C57雄性小鼠22只，體質量為（18.0±2.0）g，隨機分為4組：安靜對照組（C組，n=5），運動對照組（E組，n=5），炎癥性腸病安靜組（IC組，n=7），炎癥性腸病運動組（IE組，n=5），分組后進行耳標編號。SPF級鼠房飼養，自由進食、飲水，室溫為20℃～25℃，相對濕度為45%～55%，每日光照時長為12 h。

1.2 炎癥性腸病造模

采用濃度為5%的葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS；M=35～50 kDa；Sigma-Aldrich St.Louis，United States）水溶液，自由飲用1周構建小鼠的炎癥性腸病模型，以每只小鼠每日體質量下降百分比、大便性狀和便隱血程度檢測小鼠炎癥性腸病的疾病活動情況。造模結束后，從IC組隨機選取2只小鼠進行結腸評估。

1.3 運動方案

實驗結合Cook等（2013）和Saxena等（2012）的運動方案，選取中低強度來制訂運動負荷，采用BCPF-98型生物醫學動物跑臺進行訓練。運動適應1周后，進行為期6周的階梯遞增式中低強度跑臺運動，每周訓練6天，每天運動30 min，每日稱重，通過血清C反應蛋白與MPO來評價運動強度是否對小鼠機體產生應激反應（表1）。

表1 小鼠跑臺運動的干預方案Table 1 Treadmill Training Protocol for Mice

1.4 取材

小鼠分組編號后，每周取每只小鼠的糞便樣本，-80℃凍存。在小鼠6周訓練結束36 h取血液樣本后，測量4組小鼠結腸長度，并對結腸進行評分后用冰PBS溶液沖洗結腸內容物，將標本置于4%中性甲醛中固定，待制成石蠟切片。

1.5 指標檢測

1）疾病活動性指數（disease activity index,DAI）、組織學損傷評分、宿主免疫表達和腸道微生物群落變化。疾病活動指數：DAI=（體質量指數＋大便形狀＋出血情況）/3（表 2）。

表2 小鼠DAI評分標準（Mi-Rae et al.，2017）Table 2 Criteria for Scoring of DAI

2）炎性因子：運動干預結束36 h后，取約2 mL血液，靜置后在5℃下以3 000 r/min的轉速提取血清，ELISA測試方法檢測宿主血清IL-1β、IL-10、TNF-α和MPO。

小鼠結腸大體觀察及評分：測量每只小鼠的結腸長度，并對結腸大體的健康情況進行評定（表3）。

表3 小鼠結腸大體評分標準（Morris et al.，1989）Table 3 Criteria for Scoring of Gross Morphologic Damage

小鼠組織學觀察及評分（表4）：隨機取含病變的結腸組織，去除腸內容物，以4%中性甲醛固定，石蠟包埋切片，H.E.染色，顯微鏡觀察。

表4 小鼠結腸組織學評分標準（Scheiffele et al.，2002）Table 4 Criteria for Scoring of Histological Damage

微生物群落特征變化：對每周凍存的糞便樣本進行高通量16S rRNA基因測序，Miseq測序得到的PE reads首先根據overlap關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，區分樣本后進行OTU聚類分析和物種分類學分析，可以對OTU進行多種多樣性指數分析，以及對測序深度的檢測；基于分類學信息，可以在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。在上述分析的基礎上，可以對多樣本的群落組成進行差異顯著性檢驗，對其系統發育信息進行多元可視化分析。

DNA抽提和PCR擴增：根據E.Z.N.A.?soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000檢測，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對V3-V4可變區進行PCR擴增，擴增程序為：95℃預變性3 min，27個循環（95℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸10 min（PCR儀：ABI GeIEAmp?9700型）。擴增體系為20 uL，4 uL 5×FastPfu緩 沖液 ，2 uL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 uL 引 物（5 umol/L），0.4 uL FastPfu聚合酶，10 ng DNA模板。

1.6 統計方法

采用UPARSE軟件，根據97%的相似度對序列進行OTU聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數據庫（SSU123），設置比對閾值為70%。其余數據均采用SPSS 25.0統計軟件處理，用平均值±標準差表示。組間比較分別采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有高度顯著性。

2 研究結果

2.1 造模評估

炎癥性腸病造模期間，每日對造模組小鼠進行便隱血測試并記錄測試結果，造模第4天便隱血程度＋＋＋及以上達50%，第5天便隱血程度＋＋＋及以上達75%，第7天便隱血程度＋＋＋及以上達100%。

造模1周后，從IC組隨機選取2只小鼠進行結腸組織學觀察，作為本次炎癥性腸病造模評價。與正常對照組比較，DSS誘導IBD造模后小鼠腸道組織發生了明顯的病理改變（圖1），小鼠腸隱窩結構遭到破壞、杯狀細胞消失、腸粘膜潰瘍形成，可見大量炎性細胞浸潤，腸壁增厚，高倍鏡下有多發的出血點。

圖1 小鼠結腸內膜的病理組織學變化（×200）Figure 1.Histopathological Changes of Colonic Intima in Mice（×200）

結合IBD造模小鼠便血情況和組織學觀察結果，判定本次炎癥性腸病小鼠模型造模成功。

2.2 小鼠對跑臺運動的反應與適應

安靜對照組（C組）和運動對照組（E組）在運動訓練前后均活潑好動，皮毛緊密光滑，干凈潤澤，目光有神，體質量穩步增長。炎癥性腸病安靜組（IC組）與炎癥性腸病運動組（IE組）在造模期皮毛枯槁，目光倦怠、驚懼，反應遲鈍，肛門脫垂，體質量嚴重下降。運動干預期結束后，IE組小鼠比IC組更為活潑，毛色更為光亮，大便性狀更為健康。

實驗前，各組小鼠體質量無顯著性差異（P＞0.05）；造模結束后，IC組與IE組體質量顯著下降（P＜0.05）；運動干預后，E組與IE組體質量均顯著增加（表5）。

表5 實驗前后各組小鼠體質量變化Table 5 Changes in Mice Body Weight During Breeding in Various Groups M±SD，g

運動后，通過監測小鼠全血C反應蛋白（C-reactiveprotein，CRP）來評價小鼠對采用的跑臺運動的適應情況。研究表明，運動能夠降低小鼠全血CRP［安靜組（2.78±0.13）mg/L，運動組（2.25±0.34）mg/L］的含量。說明本次負荷的跑臺運動作為一種運動刺激，其強度和運動量構成的運動負荷未對小鼠產生應激反應，表明本研究的運動建模是一種良性適應。

2.3 DAI及結腸病理評分

2.3.1 小鼠結腸DAI分析

實驗前后，對小鼠進行炎癥性腸病的DAI評分（圖2a），取材后對小鼠結腸進行組織學評分（圖2b）。運動前中期（1～4周），IC與IE組的DAI評分均有所下降，IE組降幅高于IC組，提示低強度有氧運動對炎癥性腸病有轉愈效果；運動后期（5～6周），IE組DAI回升，提示后期可能由于運動強度的升高，導致炎癥性腸病的反復。

圖2 運動干預下IBD小鼠結腸DAI評分及組織學評分變化Figure 2.Changes of DAI and Histological Score in Colon of IBD Mice after Exercise Intervention

2.3.2 造模與運動干預后小鼠結腸的病理組織學分析

經過H.E.染色，正常對照組（C組）小鼠腸腺清晰、排列整齊、無明顯炎性細胞浸潤、絨毛排列整齊、無明顯斷裂。與正常對照組比較，DSS誘導IBD造模后小鼠腸道組織發生明顯的病理改變，小鼠腸隱窩結構遭到破壞，可見大量炎性細胞浸潤，絨毛排列雜亂無序，可見明顯斷裂，絨毛長度縮短，腸壁增厚，杯狀細胞消失，高倍鏡下有多發的出血點。運動干預期結束后，與IC組相比，IE組的炎癥浸潤明顯減少，腸道腺體結構有所恢復，杯狀細胞數量有所增加（圖1）。

2.4 小鼠腸道微生物的變化

2.4.1 腸道微生物OTU聚類及物種多樣性變化

根據宏基因組學技術，PCR正式采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL 反應體系，通過16 s rRNA測序技術得到各樣本的序列，UPARSE軟件根據97%的相似度對序列進行OTU聚類，一共獲得901 122條有效序列（397 857 710 bp），平均長度為441.472 580 317。 再 通 過 OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類和豐度統計，對測序中的有效數據進行處理。

通過各組菌屬總和的比較發現，IBD建模組菌群屬種數明顯降低，而IE組較IC組有一定的增加趨勢，但未有顯著差異性變化（圖3a）。E組小鼠腸道菌群數量顯著高于其他組（圖3b）。

圖3 運動干預和造模后各樣本的菌群數量的多樣性變化Figure 3.Microbial Diversity Changes after Exercise Interventionand IBD Modeling

2.4.2 運動干預后小鼠腸道優勢菌群的群落特征分析

在門水平上，物種腸道的群落組成分析發現：IBD造模引起擬桿菌門（Phylum Bacteroidetes）顯著減少，運動后IC組有升高趨勢；正常小鼠和IBD小鼠腸道內厚壁菌門（Phylum Firmicutes）、放線菌門（Phylum Actinobacteria）、Saccharibacteria菌門和疣微桿菌門（Phylum Verrucomicrobia）均顯著增加，擬桿菌門（Phylum Bacteroidetes）顯著減少，IBD造模后菌群種屬的多樣性增加；同時，運動減少了正常小鼠腸道內變形桿菌的數量（圖4a，表6）。門水平的優勢群落的差異性分析顯示，運動引起的小鼠腸道內厚壁菌門（Phylum Firmicutes）、放線菌門（Phylum Actinobacteria）、Saccharibacteria菌門和疣微桿菌門（Phylum Verrucomicrobia）的增加具有顯著性水平（圖4b）。

圖4 各組小鼠腸道微生物群落組成分析與單因素方差分析Figure 4.Intestinal Microbial Community CompositionAnalysis and One-WayANOVAof Each Mice

2.4.3 運動干預后小鼠腸道優勢菌群的物種組成分析

在優勢群落變化特征的基礎上，對C組、E組、IC組和IE組各樣本進行物種組成的差異分析（表6），根據得到的群落豐度數據，進行組間差異顯著性檢驗，運用統計學方法檢測4組微生物群落中豐富度存在差異的微生物：1）與C組相比，E組的Firmicutes菌顯著增加（P＜0.05），IC組的Firmicutes菌增長更為顯著（P＜0.000 1）；與E組相比，IE組的Firmicutes顯著增加（P＜0.000 1）；與IC組相比，IE組的Firmicutes有所增加但未達到顯著差異（P＞0.05）。2）IB造模引起E組的Actinobacteria菌門顯著升高（P＜0.000 1），運動干預后顯著逆轉Actinobacteria菌門增加的趨勢（P＜0.05）。3）與C組相比，E組的Saccharibacteria菌門豐度有所升高，IBD造模同樣引起該菌門物種的豐度顯著升高（P＜0.05），運動并沒有逆轉該菌門豐度升高的趨勢，提示該菌門是一種對造模炎性刺激和運動刺激非常敏感的菌屬群落。4）與C組相比，E組疣微桿菌門（Phylum Verrucomicrobia）顯著增加（P＜0.000 1），但IBD造模后和運動干預后均無顯著性變化。5）與C組相比，IBD造模組后擬桿菌門（Phylum Bacteroidetes）均顯著下降（P＜0.05），但運動干預后擬桿菌門豐度具有逆轉增加的趨勢（P＜0.05）。提示，擬桿菌門豐度可作為干預IBD腸道菌群的靶向干預群落。

表6 各組腸道微生物群落變化特征的組間單因素分析表Table 6 Characteristic Changes of Intestinal Microbial Community under One-WayANOVA

2.5 宿主功能與免疫炎性因子的變化

在健康小鼠中，運動組血清IL-10、TNF-α和MPO的表達量均顯著高于安靜組；在炎癥性腸病小鼠中，運動組IL-1β和IL-10的表達量均顯著高于安靜組（表7）。

表7 運動干預后小鼠血清炎性因子的變化Table 7 Serum Immune Expression of Mice after Exercise Intervention M±SD

3 分析討論

3.1 運動通過改變腸道菌群的組成促進宿主腸道健康

根據本實驗宏基因組學的16sRNA測序的結果表明，在門水平上，運動后正常小鼠和IBD小鼠腸道內厚壁菌門、放線菌門、Saccharibacteria菌門和疣微桿菌門均顯著增加，擬桿菌門顯著減少，菌群豐度增加。運動增加厚壁菌門，而厚壁菌門（如毛螺菌屬、瘤胃球菌屬等多種菌群）可代謝產生產丁酸鹽（OH et al.，2014）。丁酸鹽對腸道起到很好的保護作用，可調節NF-κB活化引起的結腸癌和炎癥等腸病，還可影響腸道微生物環境組成并降低腸道pH值，起到促進結腸上皮細胞的增殖和降低結腸直腸癌風險的作用。同時，大腸中丁酸鹽的產量，與腸上皮細胞的健康和維持腸上皮細胞功能結構的熱休克蛋白70（Hsp 70）的產量密切相關（Oh et al.，2014；Jiang et al.，2017）。

研究證實，腸道變形菌門能夠反映微生態失調或者不穩定的腸道微生物群落結構（Neish et al.，2014；Sokol et al.，2017；Takahashi et al.，2016）。健康的哺乳動物腸道含有變形菌的共生細菌，當這些細菌的數量較少時，表現為良性，但在某些腸道環境下，會成為可以引發腸炎的腸道微生物。在單純運動組，健康小鼠運動干預后的變形菌門的種屬低于安靜組，提示適度運動可通過改變小鼠腸道致病菌的種類，從而有利于改善機體腸道的微生態平衡；但在IBD建模以后，運動組的變形菌門數量反而高于安靜組，提示小鼠在炎癥性腸病和運動的雙重刺激下，微生態失衡加劇，因此在炎癥性腸病小鼠的運動干預中，對運動強度的把控要求更為嚴格。本實驗選擇小鼠C反應蛋白和MPO作為適度運動的強度把控指標。

3.2 運動調節宿主免疫表達改善機體慢性炎癥狀態

本實驗中，健康小鼠運動組血清IL-10、TNF-α和MPO的表達量均顯著高于安靜組；在炎癥性腸病小鼠中，運動組IL-1β和IL-10的表達量均顯著高于安靜組。研究發現，IL-10作為血清中重要的抑炎因子，具有廣泛抑炎作用和對機體腸道上皮細胞的炎癥抑制特異性（Bermon et al.，2015；Sartor et al.，2017）。健康小鼠運動組的 IL-10 表達量顯著高于安靜組，說明運動對健康小鼠有廣泛抑炎效果；同時，IBD小鼠運動組的IL-10表達量顯著高于安靜組，結合H.E.染色光鏡分析和DAI評分提示的運動轉愈效果，說明運動提高IBD小鼠體內的IL-10表達量對IBD小鼠的腸炎有轉愈效果。

髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）是中性粒細胞的功能和激活的生物標志物，其水平及活性變化代表嗜中性多形白細胞（polymorphonuclear，PMN）的功能和活性狀態。研究發現，MPO不僅能殺滅吞噬細胞內的微生物，而且可以釋放到細胞外，破壞多種靶物質，在機體的炎癥調節中發揮作用（Chevrier et al.，2003）。然而在特定條件下，MPO催化反應生成過量的氧化劑（HOCL、3-次氯酸絡氨酸、絡氨酰基等）超過局部抗氧化劑的防御反應時，就會導致氧化應激和氧化性組織損傷。本實驗中，健康小鼠運動組MPO的表達量顯著高于安靜組，而運動對IBD小鼠MPO的表達量有提高但不顯著，提示小鼠在本實驗采用的運動強度下沒有出現過量應激現象。

值得注意的是，在實驗中出現運動使得健康組小鼠血清TNF-α表達量提高，IBD小鼠血清IL-1β提高的現象。在健康小鼠中，運動對抑炎因子IL-10表達量的提升作用強于TNF-α。可以推測，實驗中運動引起健康小鼠血清TNF-α高表達可能是機體為了維持自身免疫平衡的適應性反應。在IBD小鼠中，運動強化了IL-1β的表達，結合小鼠DAI評分后期（4～6周）的趨勢，提示在對IBD小鼠進行運動療法時，需要更低的運動強度。

4 結論

1）適度跑臺運動干預后，IBD小鼠結腸上皮的炎性損傷得以逆轉，提示適度運動對促進結腸上皮的形態修復具有良好的轉歸作用。

2）本次跑臺運動后小鼠機體血清炎癥相關因子的選擇性變化表明，適度運動有效抑制炎癥反應，其干預炎癥腸病的機制可能與運動激活腸道的固有免疫相關。

3）研究基于宏基因組學腸道微生物種屬的多樣性變化和優勢微生物群落的特征變化提示，運動可逆轉腸道微生態失衡，且本次建模的IBD小鼠在進行跑臺運動后腸道微生物種屬的多樣性增加，其優勢微生物群落的主體地位得到鞏固。