氟胺酮和氯胺酮的毒性比較研究*

李鋒，楊夢香，賴苗軍，喬艷玲，5，魏佳韻，崔巍，沈昊偉，王優美，5，徐鵬，5**，狄斌**

（1.中國藥科大學，江蘇 南京 210009；2.國家禁毒委員會辦公室-中國藥科大學禁毒關鍵技術聯合實驗室，北京 100193；3.寧波大學醫學院，浙江 寧波 315211；4.浙江省戒毒研究重點實驗室，寧波市康寧醫院，浙江 寧波 315201；5.毒品監測管控與禁毒關鍵技術公安部重點實驗室，公安部禁毒情報技術中心，北京 100193）

苯環利啶類物質是一類非競爭性N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體拮抗劑，氯胺酮是該類精神活性物質的代表性物質。與氯胺酮結構和作用相似的一類藥物濫用現象逐漸顯現，如氟胺酮、MXE、DCK 和NENK 等，而國內氟胺酮的濫用現象尤為突出[1-2]。氟胺酮于1987 年由王世玉等首次合成[3]，尚無合法的醫療用途。近年來，奧地利、瑞士、美國、英國、荷蘭、加拿大、西班牙、丹麥等國家在繳獲物、全血及毛發樣品中陸續檢出了氟胺酮[4-7]。而我國在多個地方也出現了氟胺酮濫用，廣西、廣東、江蘇、福建、湖南、香港等地在繳獲物、污水及尿液樣品中檢出了氟胺酮[2，8-11]。國內外氟胺酮濫用日趨嚴重，但關于該物質的藥理學研究甚少。氟胺酮主要作用于神經系統和心血管系統，如幻覺、意識喪失、抽搐、運動抑制、高血壓、心動過速，部分會出現呼吸抑制、惡心嘔吐、肝腎功能紊亂等[11-12]，其作用機制尚不清楚。研究表明[3，13]，氟胺酮的麻醉作用類似于氯胺酮，有效劑量和蘇醒時間均優于氯胺酮，但文獻均未給出具體實驗數據。本研究對氟胺酮的急性毒性和神經毒性進行研究，并與常見毒品氯胺酮進行了比較，以期為氟胺酮的濫用防治及相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞

健康SPF 級ICR 雄性小鼠，體重為18～22 g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010。飼養環境：溫度控制在25±1 ℃，濕度維持在50%±10%，采用12 h 人工光照明暗交替。實驗動物在動物房適應性飼養至少2 d，可自由攝食飲水。SH-SY5Y、PC12 和SN4741 細胞系購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。對實驗動物進行的操作均符合實驗動物倫理學，遵循國家動物使用和保護委員會頒布的相關條例。

1.2 儀器與試劑

多功能酶標儀，美國Thermo Scientific 公司；氟胺酮和氯胺酮，純度均大于98%，由公安部禁毒情報技術中心提供；0.9%氯化鈉注射液，石藥銀湖制藥有限公司；細胞分化誘導劑視黃酸，Merck 公 司；3-（4，5- 二 甲 基 噻 唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT），Merck 公司；十二烷基硫酸鈉（SDS），國藥集團化學試劑有限公司。MTT 溶 液：用PBS 配 成5 mg/ml；SDS 溶液：10%的SDS 溶液用1 mol/L 鹽酸溶液調整pH至2。

1.3 小鼠急性毒性實驗

采用“上下法”測定氟胺酮和氯胺酮的小鼠急性毒性，給藥方式包括灌胃給藥、皮下給藥、腹腔給藥和尾靜脈給藥4 種方式。灌胃給藥、腹腔給藥、皮下給藥以500 μl 固定體積，尾靜脈給藥以200 μl 固定體積。起始劑量低于半數致死量（median lethal dose，LD50）的估計值，在AOT425 StatPgm 軟件的指示下對實驗小鼠逐只給藥，劑量級數因子為1.32，在實驗中劑量級數因子保持不變；給藥后觀察2 d，如果 2 d 后動物死亡，則降低劑量；如果2 d 后動物仍存活，則增加劑量。實驗結果通過軟件的計算可得到該種給藥方式下小鼠的LD50值及95%置信區間。

1.4 神經細胞毒性實驗

取對數生長期的細胞，用酶分散法制備成細胞懸浮液。用細胞培養液稀釋細胞懸浮液，調整濃度至1×105個細胞/ml，于96 孔細胞培養板內接種每孔100 μl。37 ℃，5% CO2條件下培養24 h。取出96 孔細胞培養板，加入細胞分化誘導劑后繼續培養2 d。培養2 d 后，隨機分成氟胺酮組和氯胺酮組，氟胺酮組加入不同濃度（0.1、0.3、1、3、10 mmol/L）氟胺酮，氯胺酮組加入不同濃度（0.1、0.3、1、3、10 mmol/L）氯胺酮，每個濃度設置3 個重復孔。取出96 孔細胞培養板，棄去培養液后，每孔加入100 μl 的氟胺酮或氯胺酮，加樣后繼續培養24 h。終止培養前避光向每孔加入 10 μl MTT 溶液，搖勻置于37 ℃培養箱繼續孵育4 h 后，再向每孔加入100 μl SDS 溶液，37 ℃孵育20 h。用酶標儀檢測 570 nm 波長下每孔的吸光度（optical density，OD）值。結果以3 個復孔的均值表示，按公式計算細胞的存活率：細胞存活率（%）=OD1/OD2×100%。其中OD1表示給藥組的平均吸光度值，OD2表示陰性對照的平均吸光度值。最后通過氟胺酮和氯胺酮的濃度-反應曲線的非線性擬合，獲得氟胺酮和氯胺酮的半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.5 統計方法

小鼠急性毒性實驗通過AOT425 StatPgm 軟件進行計算得到小鼠4 種不同給藥方式的LD50值和95%置信區間。神經細胞毒性實驗通過MTT 實驗數據繪制得到氟胺酮和氯胺酮的濃度-反應曲線，對其反應曲線方程進行非線性擬合，從獲得的方程式中計算氟胺酮和氯胺酮的IC50值。

2 結果

2.1 小鼠急性毒性實驗結果

氟胺酮的小鼠4 種給藥方式LD50值大小順序與氯胺酮的一致，其順序為尾靜脈給藥＜腹腔給藥＜皮下給藥＜灌胃給藥。氟胺酮和氯胺酮的LD50均 值 分 別 為294.00 mg/kg 和241.78 mg/kg。氟胺酮和氯胺酮通過4 種不同給藥方式所得小鼠LD50值、95%置信區間結果見表1。

表1 氟胺酮和氯胺酮4 種不同給藥方式的小鼠實驗結果[LD50（95%置信區間），mg/kg]

2.2 神經細胞毒性實驗結果

氟胺酮與氯胺酮對三種細胞系的IC50值大小順序一致，其均值分別為14.57 mmol/L和4.55 mmol/L，實驗結果見表2 和圖1。

圖1 氟胺酮和氯胺酮誘導SH-SY5Y 細胞、PC12 細胞、SN4741 細胞的死亡

表2 氯胺酮和氟胺酮的神經毒性[IC50（95%置信區間），mmol/L]

3 討論

3.1 急性毒性比較

急性毒性實驗結果通常用LD50值來反映，LD50值越小說明毒性越大。目前文獻中關于氯胺酮的急性毒性報道較多，有文獻報道小鼠腹腔給藥氯胺酮的LD50值約為360 mg/kg，是苯環利啶的4.65 倍[14]，另一篇文獻報道了嚙齒類動物的灌胃給藥氯胺酮的LD50均值約為600 mg/kg[15]。氟胺酮與氯胺酮的化學結構高度相似，是在保持氯胺酮總體構架不變的基礎上，僅用氟原子代替了氯原子，但目前尚沒有關于氟胺酮的急性毒性數據報道。法國首例氟胺酮相關致死案例，在死者外周血、尿液、膽汁和玻璃體液均檢出了氟胺酮，推斷致死原因是同時攝入氟胺酮（主要因素）、3-MeO-PCE、5-MeO-DMT、安非他明和可卡因的“雞尾酒效應”導致的呼吸抑制[16]。本文對氟胺酮和氯胺酮進行了4 種不同給藥方式的小鼠急性毒性評估。因氟胺酮和氯胺酮主要以鼻吸或口服形式濫用，而鼻吸主要是通過呼吸區的豐富毛細血管進入體循環，吸收速度接近靜脈注射，灌胃給藥是通過胃黏膜等方式間接吸收入血。因此本實驗中的小鼠尾靜脈注射給藥方式可一定程度上模擬人鼻吸給藥，而灌胃給藥則可模擬人的口服給藥。實驗結果顯示，氟胺酮的小鼠4 種給藥方式LD50值分別為尾靜脈給藥92.57 mg/kg、腹腔給藥231.00 mg/kg、皮下給藥365.90 mg/kg、灌胃給藥486.5 mg/kg，其大小順序與氯胺酮的一致，依次為尾靜脈給藥＜腹腔給藥＜皮下給藥＜灌胃給藥，說明這兩種物質的急性毒性均是尾靜脈給藥毒性最大，灌胃給藥毒性最小，同時也間接說明了不同濫用形式對氟胺酮和氯胺酮濫用者的危害程度具有不同的影響。氯胺酮的腹腔給藥和灌胃給藥的急性毒性數據（LD50）與文獻報道相近[14-15]。氟胺酮和氯胺酮的小鼠4 種給藥方式的LD50均值分 別 為294.00 mg/kg 和241.78 mg/kg，以 小 鼠4種給藥方式的LD50均值為標準，氟胺酮的急性毒性作用為氯胺酮的82.24%。

3.2 神經毒性比較

絕大部分新精神活性物質具有明顯的神經毒性，國際公認神經毒性數據是評估新精神活性物質危害性的關鍵性指標[17]。NMDA 受體拮抗劑在不同動物體內均能產生神經毒性，表現為神經元或軸突的退行性變及區域性腦細胞死亡[18]。研究發現[19-20]，苯環利啶和MK-801 可誘導大鼠后扣帶回皮質和壓后皮質出現神經病理學變化或損傷，這種變化可能是神經元胞漿空泡化，后來被證實是胞質空泡化（如內質網、線粒體腫脹或破裂）。本研究通過對具有多巴胺能神經元特征的SH-SY5Y、PC12 和SN4741 細胞系進行實驗，采用MTT 法檢測氟胺酮的神經細胞毒性作用，并與氯胺酮比較，結果顯示氟胺酮對SH-SY5Y、PC12 和SN4741 三 種 細 胞 系 的IC50值 依 次 為7.91 mmol/L、17.63 mmol/L 和18.18 mmol/L，與氯胺酮的IC50大小順序一致，說明兩種物質均對SH-SY5Y 細胞毒性作用最大，對SN4741 細胞毒性作用最小。冰毒是我國濫用人數最多的毒品，有研究對冰毒的神經毒性進行了研究，結果發現冰毒對SH-SY5Y、PC12 和SN4741 三種細胞系的IC50值依次為5 mmol/L、2 mmol/L 和 4 mmol/L[17]。以IC50均值為標準，氟胺酮的神經毒性為氯胺酮的31.23%，是冰毒的25.17%。這些結果發現，氟胺酮的神經毒性比常見毒品冰毒和氯胺酮的神經毒性都低，這可能是其濫用呈上升趨勢的原因之一。

3.3 總結

綜上所述，氟胺酮與氯胺酮具有一樣明顯的急性毒性和神經毒性。氟胺酮的急性毒性為氯胺酮的82.24%，神經毒性為氯胺酮的31.23%。盡管實驗結果顯示氟胺酮的毒性作用小于氯胺酮，但考慮到近年來氟胺酮在我國濫用人數的急劇增加及快速蔓延趨勢，其危害性不容忽視。