分散固相萃取-氣質聯用法快速測定蜂蜜中112種農藥殘留

鄭劍峰， 董葉箐， 俞婕， 鐘寒輝， 韋棟屹， 虞祖苗， 孫文閃

(綠城農科檢測技術有限公司，浙江 杭州 310051)

蜂蜜是一種純天然的滋養食品，富含果糖、葡萄糖、維生素、氨基酸、礦物質、生物酶等營養成分，具有增強免疫力、殺菌、保護肝臟、促進胃腸蠕動以及改善睡眠等保健功能，在食品行業得到廣泛的應用，然而蜂農不恰當地使用農藥和蜜蜂采集被農藥污染的花粉，可能導致農藥在蜂蜜中殘留甚至超標。研究表明，世界上超過75%的蜂蜜存在農藥殘留[1]。我國是蜂蜜養殖大國，每年蜂蜜總產量超50萬t，占世界蜂蜜總產量的1/4以上[2]，同時蜂蜜也是我國的傳統出口商品之一，日本、美國和歐盟等國家和地區都對蜂蜜中的有機磷和菊酯類農藥制定了最大殘留限量，并且不斷對蜂蜜農藥殘留標準、規則進行調整[3]。作為蜂蜜出口大國，我國也出臺了蜂蜜相關檢測標準及蜂蜜中農藥最大殘留限量標準。加強對蜂蜜中農藥殘留的檢測具有重要的現實意義，既可以保護人們的身體健康，又有利于蜂蜜的出口貿易。因此，建立一種簡單、快速、靈敏、準確的蜂蜜中多種農藥殘留的檢測方法，對于保障人民舌尖上的安全非常重要。

目前，蜂蜜中農藥殘留的分析方法有氣相色譜法[4-5]、氣質聯用法[6-7]和液質聯用法[8-12]。氣相色譜法分析時間長，選擇性差且易出現假陽性；液相色譜-質譜法分析時間短，選擇性強，但是大部分脂溶性農藥在液質上響應低或者無響應，前處理的凈化方法主要有固相萃取凈化和分散固相萃取凈化，固相萃取凈化法存在有機試劑消耗量大、時間長、效率低、成本高等缺點。分散固相萃取凈化法[13-16]由于其簡單、可靠、快速、經濟的優點在蔬菜水果農藥多殘留的檢測中大量應用，而在蜂蜜樣品多農藥殘留前處理應用的研究相對較少。本文通過對分散固相萃取凈化的前處理和儀器條件的優化建立了可以快速檢測蜂蜜中112種農藥殘留的方法，該方法具有操作簡單、分析時間短、抗干擾能力強、靈敏度和準確度高等優點，為蜂蜜中多農藥殘留分析提供了快速的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

蜂蜜樣品從超市購買。

Agilent 7890B/7000C氣相色譜-串聯質譜儀、HP-5MS色譜柱(20 m×0.25 mm，0.25 μm，美國Agilent公司)；ST16R 離心機(美國賽默飛世爾公司)；BSA2202S電子天平(德國賽多利斯公司)；漩渦混合器(TALBOYS)；KQ5200E超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；Reeko AutoEVA-20全自動氮吹濃縮儀(杭州博睿科儀器有限公司)。

克百威、2,4-二甲基苯胺、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、特丁硫磷、樂果、δ-六六六、滅線磷等112種標準品(純度>98.0%)購自德國DnEhrensmUerGmUH公司；內標外環氧七氯(純度99.5%)購自德國DnEhrensmUerGmUH公司；乙腈、丙酮、甲醇(色譜純)購自美國Merck公司；N-丙基乙二胺 (N-propylethylenediamine，PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、0.22 μm聚四氟乙烯濾膜購自天津博納艾杰爾科技有限公司；氯化鈉、無水硫酸鎂(分析純)購自廣州化學試劑廠，無水硫酸鎂使用前需在馬弗爐中550 ℃烘干4 h。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

HP-5MS色譜柱(20 m×0.25 mm×0.25 μm)與空心柱串聯(5 m×0.25 mm)，進樣口溫度280 ℃，柱流量1.4 mL·min-1；采用程序升溫：起始柱溫80 ℃，保持0 min，以40 ℃·min-1升溫至160 ℃，保持0 min，再以20 ℃·min-1升溫至290 ℃保持1.5 min，總用時12.0 min；進樣量2 μL，不分流進樣，載氣為高純氦氣，碰撞氣為高純氬氣，純度≥99.999%。

1.2.2 質譜條件

電離方式為EI；色譜-質譜接口溫度為280 ℃；電離能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；檢測器電壓為1 798 V；數據采集為多重反應監測；定量方式為內標法；112種農藥的質譜參數見表1。

表1 112種農藥的GC-MS/MS分析參數

表1(續)

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取

稱取蜂蜜樣品(2.50±0.01)g于50 mL離心管中，加入8 mL一級水，2 500 r·min-1渦旋振蕩1 min，再加入15 mL乙腈，2 500 r·min-1渦旋振蕩1 min，超聲提取20 min后，加入5.0 g氯化鈉、2.00 g無水硫酸鎂，2 500 r·min-1渦旋振蕩1 min，8 000 r·min-1離心3 min，上清液待凈化。

1.3.2 凈化

取1.3.1待凈化液8 mL至15 mL離心管中，加入0.10 g C18、0.20 g PSA、0.50 g無水硫酸鎂，2 500 r·min-1渦旋振蕩1 min，8 000 r·min-1離心3 min，取出6.00 mL置于10 mL刻度管中，40 ℃氮吹至近干，準確加入1.0 mg·L-1外環氧七氯100 μL，再準確加入900 μL正己烷，2 200 r·min-1渦旋30 s，超聲30 s，過0.22 μm有機濾膜，待上機。

1.4 標準溶液的配制

分別準確稱取一定質量各農藥及內標外環氧七氯，用正己烷溶解，定容至50 mL容量瓶中，分別配制成500 mg·L-1的標準儲備溶液，于4 ℃冰箱避光保存；分別準確移取0.50 mL標準儲備液，用正己烷稀釋定容于100 mL容量瓶中，配制成2.5 mg·L-1混標標準中間液。準確移取0.50 mL內標儲備液稀釋到50 mL容量瓶中，得到5.0 mg·L-1內標中間液，于4 ℃冰箱避光保存。取蜂蜜空白樣品經過1.3.1提取和1.3.2凈化后的基質溶液配制0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.50 mg·L-1基質混合標準曲線。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 提取溶劑的選擇

蜂蜜樣品因其黏稠度大，直接加入試劑進行提取效果較差，而蜂蜜的主要成分為果糖和葡萄糖等糖類，因此，可以加入純水進行溶解稀釋來降低黏稠度，然后再加入提取劑進行萃取，來改善提取效果，當樣品量為2.50 g時，比較加入不同體積(4、6、8、10、12 mL)純水對提取回收率的影響，試驗發現當純水的加入體積為8 mL時，提取回收率已達到穩定值，因此，加入純水的最佳體積為8 mL。當蜂蜜的樣品量為2.50 g，加入純水體積為8 mL時，比較甲醇、乙腈、丙酮3種溶劑對蜂蜜樣品中112種農藥組分提取的效果(加標濃度為0.5 mg·kg-1，n=6)。當采用甲醇提取時，由于極性較強，甲醇與水難以通過鹽析分層，提取回收率較差。而采用乙腈和丙酮提取時，農藥組分有較好的溶解性，加入氯化鈉和無水硫酸鎂后，丙酮、乙腈與水容易分層，提取回收率比較理想，分別達到了82.1%～103%和81.6%～105%。但是丙酮為易制毒試劑，采購領用等程序比較繁瑣，因此，選取乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 提取劑體積的優化

當蜂蜜的樣品量為2.50 g，加入純水體積為8 mL時，比較不同體積(6、10、12、15、20 mL)乙腈的提取效果(加標濃度為0.5 mg·kg-1，n=6)，以回收率作為考察指標，試驗結果表明，回收率隨著提取體積的增加而升高，當體積增加到15 mL時，回收率已達到穩定，為了避免有機試劑的浪費以及可能對環境造成的污染，選擇乙腈的提取體積為15 mL。

2.1.3 提取時間的優化

提取溶劑和體積確定了以后，需要對提取時間進行優化，本研究比較不同超聲時間(10、15、20、25、30 min)的提取效果(加標濃度為0.5 mg·kg-1，n=6)，以提取回收率作為考察指標，結果表明，提取回收率隨著超聲時間的增加而升高，當超聲時間達到20 min之后，回收率無明顯的提高，因此，最佳的超聲時間為20 min。

2.1.4 凈化方法的選擇和優化

蜂蜜樣品經過水-乙腈提取鹽析分層，農藥組分被分配到乙腈層中，而部分糖類和大部分有機色素也會溶解在乙腈層，這些物質的存在會對上機測定產生干擾，進而影響檢測結果的準確性，因此，需要對提取液進行凈化，提高檢測結果的準確性。農藥殘留常用的凈化方法為固相萃取凈化和分散固相萃取凈化，固相萃取凈化成本高、效率低、有機試劑消耗量大，與固相萃取凈化相比，分散固相萃取凈化簡單、可靠、快速、經濟，常用的凈化劑為PSA、C18和無水硫酸鎂。其中無水硫酸鎂的作用主要是除去提取液的水分，經過試驗比較，0.5 g可以將水分去除。而PSA和C18可以去除糖類和色素等物質，本研究比較了PSA、C18不同用量組合對凈化效果和回收率的影響，結果表明，當0.1 g C18和0.2 g PSA組合時的回收率最好，凈化粉用量過低時，雜質去除效果較差；凈化粉用量過高時，部分農藥組分被PSA吸附，導致回收率低。因此，采用0.1 g C18、0.2 g PSA和0.5 g無水硫酸鎂組合凈化。

2.2 儀器條件的優化

2.2.1 質譜條件的優化

在電子轟擊離子源(EI)電離模式下對112種農藥組分進行一級質譜掃描(Q1 Scan)，分別找到各個化合物的母離子，在3～45 eV進行碰撞能量的優化，對選定的母離子峰進行子離子掃描，根據子離子掃描質譜圖，選擇離子強度最大的為定量離子，離子強度次之的為定性離子。112種農藥化合物優化后的離子對和碰撞能量參數見表1。

2.2.2 氣相條件的優化

通常情況下，氣相色譜-質譜完成112種農藥組分的分離需要80 min以上，本研究采用三重四級桿質譜的多重反應監測模式，在該模式下，離子對掃描具有高選擇性和特異性，采用HP-5MS色譜柱(20 m×0.25 mm×0.25 μm)，分離結合升溫程序的優化，實現了12 min內完成112種農藥分析，同時為了避免色譜柱進口端的污染，在色譜柱進口端與空心柱串聯(5 m×0.25 mm)，而不影響分析時間。

2.3 方法的線性范圍、檢出限及定量限

檢出限和定量限通過空白樣品加標回收試驗獲得，進樣分析信噪比(≥3)和(≥10)對應的樣品中濃度。經過試驗條件優化，112種農藥組分的檢出限為0.002 mg·kg-1，定量限為0.005 mg·kg-1。對0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.500 mg·kg-1系列濃度的混合標準基質溶液進樣分析，進行線性擬合，相關系數均>0.995，112種農藥組分在0.005～0.500 mg·kg-1線性關系良好。

2.4 方法的準確度和精密度

方法的準確度通過空白蜂蜜樣品添加回收率來分析，精密度通過同一濃度添加6次回收率的相對標準偏差獲得，添加濃度選擇高中低(0.450、0.050、0.005 mg·kg-1)3檔濃度，從表2可以看出，本方法回收率和精密度符合GB/T 27404—2008食品理化分析方法確認的要求。

2.5 樣品基質效應的考察

基質效應指待測目標物的樣品提取物，會增強或抑制被測目標物的檢測響應，從而對檢測結果的準確度造成影響，氣相色譜-質譜方法的建立需要考慮基質效應對準確度的影響。本研究采用基質標準曲線結合內標法定量來消除蜂蜜基質效應對定量分析的影響，112種農藥組分的空白添加回收率在68.4%～102%，說明該方法可以有效地消除蜂蜜樣品的基質效應，適應于蜂蜜樣品中112種農藥殘留的測定。

表2 蜂蜜回收率和精密度(n=6)

3 小結與討論

本研究通過對樣品前處理和儀器條件的優化建立了分散固相萃取-氣相色譜串聯質譜內標法同時檢測蜂蜜中112種農藥殘留的方法，該方法操作簡單，色譜分離采用HP-5MS色譜柱(20 m×0.25 mm×0.25 μm)與空心柱(5 m×0.25 mm)串聯，12 min內完成112種農藥分析，進樣時間短，多重反應監測內標法定量，抗干擾能力強，靈敏度和準確度高，為蜂蜜中多農藥殘留分析提供快速的檢測方法。