原發性抗磷脂綜合征患者中性粒細胞關鍵基因的生物信息學分析

林梅英，甘東輝，高穎，王正杰，陳志敏

(莆田學院附屬醫院，福建 莆田 351100)

原發性抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome,APS)是一種全身性自身免疫性疾病，特點是持續性的抗磷脂抗體陽性[1]。常見的臨床表現為廣泛的靜脈、動脈或微血管血栓形成，非血栓性表現則包括瓣膜心臟病、肝纖維化、抗磷脂抗體相關腎病、血小板減少、溶血性貧血和認知功能障礙[2]。中性粒細胞已被證明在誘導血栓形成中起作用，研究[3]表明，在自身免疫性疾病中，中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps,NETs)會導致靜脈和動脈血栓栓塞，NETs 是由DNA、組蛋白和殺微菌蛋白組成的網絡，由激活的中性粒細胞通過一種名為NETosis的程序釋放出來。在APS中，抗磷脂抗體與中性粒細胞表面接觸，繞過正常的穩態機制，導致中性粒細胞異常免疫效應發生[4]。目前尚不清楚APS發生過程中中性粒細胞免疫異常具體的調控機制。隨著人類基因組計劃的完成，現階段醫學和生物學研究已經進入了后基因組時代，測序技術和微陣列技術可以在基因水平對疾病獲得更深刻的認識，通過生物信息學手段，挖掘大數據，研究疾病發生發展過程中的分子機制已經被廣泛應用于多種疾病[5]。現擬通過生物信息學方法識別APS發病過程中中性粒細胞的差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)，從基因層面為APS的機制研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 數據下載

在NCBI的綜合基因集數據庫GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)上以“antiphospholipid syndrome”“neutrophil”為關鍵詞進行檢索，下載GSE102215[6]數據集(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE102215)，該數據集基于GPL16791平臺[Illumina HiSeq 2500 (Homo sapiens)]，包含了9例APS患者的中性粒細胞RNA測序數據，9例健康人類中性粒細胞RNA測序數據。

1.2 DEGs篩選

使用R語言的limma包對表達矩陣進行差異分析，設置篩選標準為|log2FC|>1(FC為差異倍數)，矯正后P值(Padj)<0.05，獲得APS患者中性粒細胞中的DEGs。使用ggplot2包繪制差異基因火山圖，并標記出上下調基因中差異倍數前5位的基因。

1.3 基因功能和通路富集分析

提取DEGs中上調(log2FC>0)和下調(log2FC<0)的基因，使用R語言的clusterProfiler包分別對兩群基因進行基因本體論(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析。使用ggplot2包對結果進行可視化。

1.4 上調和下調DEGs的蛋白-蛋白互作網絡構建和hub基因篩選

分別將上調和下調的DEGs輸入STRING數據庫(https://www.string-db.org/)，構建蛋白-蛋白互作網絡(protrin-protein interaction,PPI)，設置交互置信度為0.4，將所得網絡導入Cytoscape 3.8軟件，使用cytohubba插件計算PPI網絡中每個節點的度值權重分數，對度值前30位的節點進行可視化，將網絡中度值前5位的基因鑒定為hub基因。

2 結果

2.1 APS中性粒細胞DEGs篩選

以|log2FC|>1,Padj<0.05為標準，在GSE102215數據集共篩選得到985個DEGs，其中上調DEGs 512個，下調DEGs 473個，圖1展示了這些基因的分布情況，上調基因中差異程度最大的5個基因為ATOH8(log2FC=3.50)、LILRA4(log2FC=3.10)、SOWAHD(log2FC=3.85)、FAM3B(log2FC=2.80)、IFIT1(log2FC=2.74)。下調基因中差異程度最大的5個基因為RORA(log2FC=-2.58)、GRASP(log2FC=-2.55)、FAT4(log2FC=-2.48)、ZNF483(log2FC=-2.47)、GFPT2(log2FC=-2.42)。

FC差異倍數；Padj矯正后P值圖1 APS中性粒細胞差異表達基因火山圖

2.2 上下調DEGs的GO、KEGG富集分析

使用clusterProfiler進行基因富集分析，上調基因主要富集到的GO條目包括固有免疫反應調節、中性粒細胞激活、對TNF的反應、對I型干擾素的反應、I型干擾素信號通路、IL-1β產生、IL-8產生等，KEGG條目包括軍團菌病、成骨細胞分化。下調基因主要富集到的GO條目包括T細胞激活、淋巴細胞分化和激活、TCR通路、T細胞選擇等，KEGG條目包括Th17細胞分化、NK細胞介導的細胞毒性等。見圖2。

2.3 蛋白-蛋白互作網絡構建和hub基因鑒定

將上調DEGs輸入STRING后得到了一個包括317個節點、1 158條邊的PPI網絡，導入Cytoscape后計算網絡中每個節點的度值權重，度值越大表明該節點具有越廣泛的連接性，是網絡中的核心節點。在上調DEGs的PPI網絡中度值前5位基因為IFIT1(13)、IFIT3(11)、CCL2(11)、TLR8(10)、IFI6(10)。下調DEGs輸入STRING后得到了一個包括360個節點、2 498條邊的PPI網絡，網絡中度值前5位基因為MYC(112)、CD8A(98)、FYN(80)、CD28(78)、LCK(76)(圖3，表1)。

A 上調DEGs GO和KEGG富集點圖；B 下調DEGs GO和KEGG富集點圖;BP 生物過程；CC 細胞組分；MF 分子功能；KEGG 京都基因與基因組百科全書;Padj矯正后P值 圖2 差異表達基因的基因富集分析

A 上調DEGs PPI網絡中度值前30位基因互作網絡圖；B 下調DEGs PPI網絡中度值前30位基因互作網絡圖圖3 APS中性粒細胞差異表達基因互作網絡圖

表1 APS中性粒細胞中上調和下調的前30個hub基因及其全稱

3 討論

原發性APS可以在沒有臨床和實驗室證據的患者身上發現，其發病常伴隨其他疾病，主要包括系統性紅斑狼瘡和急性早幼粒細胞白血病，越來越多學者開始關注到APS患者中性粒細胞的異常反應[7]。目前研究[8]認為，APS的機制中最重要的就是抗磷脂抗體(antiphospholipid antibodies,aPL)的異常激活，aPL結合磷脂和各種細胞(血小板、內皮細胞、中性粒細胞、單核細胞、成纖維細胞和滋養細胞)表達的質膜蛋白，產生高凝固性血液。盡管aPL具有已知的嗜血栓性作用，但這種疾病的確切發病機制尚未完全闡明。

在上調基因構成的核心PPI網絡中，包含了一群干擾素相關基因，包括IFIT1、IFIT3、IFI6、IFI35、IFI16、IFNAR1。IFIT1、IFIT3是干擾素依賴性多蛋白復合物的組成成分。研究[9]表明，I型干擾素基因在APS患者中的表達是通過漿細胞樣樹突狀細胞途徑、Toll樣受體(TLR7和TLR9)、抗β2糖蛋白I抗體介導的中性粒細胞激活和依賴于TLR4的NETs釋放，以及隨后的B細胞和漿母細胞激活而誘導的，并可通過TLR7和TLR9等Toll樣受體、抗β2糖蛋白I抗體介導的中性粒細胞激活和中性粒細胞外陷阱釋放，進而激活B細胞和漿母細胞。在前瞻性研究中，干擾素評分高與預后差的相關性可以指導高危人群迅速治療[10]。CCL2是一種趨化因子，是參與免疫調節和炎癥過程的分泌蛋白超家族，該趨化因子是 C-C趨化因子亞家族的成員，其特征在于兩個相鄰的半胱氨酸殘基。這種細胞因子對單核細胞和嗜堿性粒細胞顯示趨化活性[11]。TLR8是Toll 樣受體家族的成員，其在病原體識別和固有免疫激活中起重要作用,是非特異性免疫系統中抵御入侵病原體的第一道防線。此前有研究[12]表明，單核細胞中TLR8異常表達與aPL相關，但中性粒細胞中TLR8異常表達目前研究尚空白。此外，FADD高表達也與APS相關，該基因編碼的蛋白質是一種銜接分子，可與各種細胞表面受體相互作用并介導細胞凋亡信號。通過其 C 端死亡域，該蛋白可以被TNFRSF6/Fas受體、腫瘤壞死因子受體、TNFRSF25和TNFSF10/TRAIL受體募集，從而參與由這些受體引發的死亡信號，這提示細胞死亡在APS中的潛在調控作用[13]。下調基因主要參與的生物學功能和通路則與T細胞激活和分化密切相關，包括CD8A、IL7R、CD3E在內的基因表達下調，這提示在APS中，通過中性粒細胞引起的多免疫細胞抑制反應可能是一種重要的調節機制。

綜上，本研究篩選到APS中性粒細胞中核心的上調基因：IFIT1、IFI35、IFI3、CCL2、TLR8、FCGR1A與核心的下調基因MYC、CD8A、FYN、CD28、LCK、GNB2L1可能與APS的中性粒細胞激活、NETs形成、免疫抑制等機制相關，本研究的局限性在于缺乏更多關于APS中性粒細胞的表達譜數據，對于篩選出來的核心基因仍需進一步實驗驗證，這將在后續研究中進一步完善。