C∕EBPβ通過pim-1介導足細胞損傷的作用機制

程維麗，陳曉攀，齊媛媛，文璐，王曉陽

系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種累及多器官的自身免疫性疾病，狼瘡性腎炎（LN）是SLE 最常見、最嚴重的并發癥之一［1］。糖皮質激素及免疫抑制劑為主的傳統誘導方案對大多數LN患者有效，但仍有部分患者對其不敏感或不能耐受［2］。因此，研究LN的發病機制并尋找新的治療靶點尤為重要。細胞焦亡是一種釋放炎性因子的程序化細胞死亡過程，參與LN的發病［3］。NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎性小體是介導細胞焦亡的多蛋白復合體［4］，在LN患者足細胞中表達上調［5］。絲氨酸∕蘇氨酸激酶1（pim-1）可調節細胞增殖及凋亡，在LN 患者腎臟組織中表達上調，pim-1 抑制劑可抑制小鼠足細胞上的NLRP3 炎性小體的激活［6］。CCAAT 增強子結合蛋白β（C∕EBPβ）屬于轉錄因子，可調節細胞增殖及分化［7］。生物信息學分析發現pim-1 的啟動子上可能有（C∕EBPβ）的結合位點，且研究證明C∕EBPβ 在SLE 患者外周血單核細胞中表達上調［8］。因此，筆者推測C∕EBPβ可能通過pim-1引起足細胞上的NLRP3炎性小體激活，導致足細胞損傷。本研究旨在探討C∕EBPβ 通過pim-1 介導足細胞損傷的作用機制，為LN的治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠腎小球足細胞購自上海賽百慷公司，在鄭州大學第一附屬醫院重點實驗室-80 ℃凍存后保存于液氮罐中。腺苷三磷酸（ATP）、脂多糖（LPS）、RPMI-1640 培養基（北京索萊寶生物科技有限公司），胎牛血清（四季青），胰酶（美國Sigma公司），雙抗（博士德），脂質體3000轉染試劑（美國Invitrogen 生命技術公司），重組小鼠干擾素-γ（北京義翹神州科技股份有限公司），siRNA-NC、siC∕EBPβ慢病毒、pim-1過表達慢病毒（吉凱基因），TRIpure、Super M-MLV 反轉錄酶、RNase inhibitor（北京Bio Teke 公司），2×Taq PCR Master Mix、SYBR Green（北京Solarbio公司），引物（上海生工生物公司），RIPA 裂解液、蛋白上樣緩沖液、5%牛血清白蛋白、BCA蛋白定量試劑盒、凝膠制備試劑盒（鼎國昌盛公司），兔抗NLRP3 抗體、p17 白細胞介素（IL）-1β 抗體、pim-1 抗體（ABclonal 公司），兔抗p20 半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-1 抗體、C∕EBPβ 抗體（中國Affinity 公司），兔抗Gasdermin D（GSDMD）抗體（中國CST），內參β-actin 抗體（美國Santa Cruz），HRP 標記山羊抗兔IgG 及小鼠IL-1β、IL-6 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（中國聯科生物），細胞染色質免疫共沉淀（chip）試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（wanleibio），優化液、質粒、pRL-TK vector、pGL3-Basic-pim-1-promotor、熒光素酶檢測試劑盒（中國凱基生物公司）；顯微鏡拍照系統、倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司），紫外分光光度計（美國Thermo 公司），熒光定量PCR 儀（韓國Bioneer 公司），化學發光儀（BioRad），電泳儀、凝膠成像分析儀（北京六一公司），酶標儀（美國Bio Tek公司），多功能酶標儀（瑞士TECAN公司）。

1.2 足細胞培養及轉染 取小鼠腎小球足細胞，消化離心后加完全培養基（10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液、20 U∕mL重組小鼠干擾素-γ、RPMI-1640 培養基），調整細胞密度至1×105∕mL，將其接種于25 cm2的用Ⅰ型膠原包被的培養瓶中，“8”字混勻后于33 ℃培養箱中誘導增殖。在37 ℃培養箱中用無干擾素-γ的完全培養基進行誘導分化。分化成熟的足細胞按1×105∕mL 的密度接種于6 孔板，分為：（1）Control 組。（2）siRNA-NC 組（用siRNA-NC 轉染足細胞）。（3）siC∕EBPβ組（用siC∕EBPβ 慢病毒轉染足細胞）。（4）Vector-NC 組（空載體轉染足細胞）。（5）pim-1-OE 組（pim-1 過表達慢病毒轉染足細胞）。培養基中加入慢病毒（感染復數=10）和轉染試劑Lipo3000，熒光顯微鏡下觀察轉染效率，轉染后3 d將細胞置于含嘌呤霉素的培養基中篩選穩轉株并凍存，備用。分化后的細胞轉染48 h 后用LPS 及ATP 進行刺激。分為：（1）LPS+ATP 組。（2）LPS+ATP+siRNA-NC 組。（3）LPS+ATP+siC∕EBPβ組。（4）LPS+ATP+siC∕EBPβ+Vector-NC 組。（5）LPS+ATP+siC∕EBPβ+pim-1-OE組。

1.3 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測C∕EBPβ和pim-1 mRNA水平 提取各組細胞總RNA，并測定RNA濃度。將RNA反轉錄成cDNA，以cDNA作為模板進行qPCR反應，根據試劑盒要求進行定量分析。反應體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10μL，上下游引物（10μmol∕L）各0.8μL，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（50×）0.4μL，cDNA 溶液2μL，滅菌水6μL。反應條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s，共40個循環；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。以β-actin 為內參，引物序列見表1，采用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA相對表達量。

Tab.1 Primers for qPCR表1 qPCR引物序列

1.4 Western blot 檢測C∕EBPβ、pim-1、NLRP3、p20Caspase-1、GSDMD、p17IL-1β蛋白表達水平 在細胞中加入RIPA裂解液，冰上靜置30 min 后離心取上清液，用BCA 法測蛋白濃度，并將剩余蛋白溶解于蛋白上樣緩沖液中，每組取20μg上樣蛋白，等量蛋白經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠分離后，轉至PVDF 膜上。用5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h。TBST清洗后，加入兔抗C∕EBPβ 抗體、pim-1 抗體、NLRP3 抗體、p20Caspase-1抗體、p17IL-1β抗體及GSDMD抗體（1∶1 000），于4 ℃搖床上孵育過夜，經TBST漂洗后，與HRP標記山羊抗兔IgG 抗體（1∶5 000）室溫孵育1 h。以β-actin 為內參。將ECL 試劑滴加到PVDF 膜上，用化學發光儀進行曝光，用Image J軟件對條帶灰度進行分析。

1.5 ELISA 檢測炎性因子IL-1β 和IL-6 水平 足細胞在4 ℃，300×g條件下離心10 min，取足細胞上清液，ELISA檢測細胞中的IL-1β和IL-6水平，用酶標儀檢測450 nm和570 nm處吸光度值，計算IL-1β和IL-6水平。

1.6 chip檢測C∕EBPβ與pim-1基因啟動子的結合 實驗分為：（1）Input 組（加入RNA 聚合酶Ⅱ）。（2）IgG 組（加入IgG）。（3）anti-C∕EBPβ組（加入C∕EBPβ抗體）。細胞培養基中加入1%甲醛進行交聯，并用甘氨酸終止交聯，超聲破碎染色質。各組加入相應的抗體、磁珠，洗滌蛋白-DNA復合物，解聯后純化收集DNA進行PCR檢測。反應體系如下：DNA模板2μL，上下游引物各1μL，2×Taq PCR Master-mix 10μL，ddH2O 補至20μL。反應條件：95 ℃5 min，95 ℃20 s，55 ℃20 s，72 ℃30 s，共35個循環；72 ℃2 min，25 ℃5 min。引物序列見表1。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗檢測C∕EBPβ與pim-1基因啟動子的結合 實驗分為：（1）Control組。（2）C∕EBPβ-OE組（加入C∕EBPβ 過表達載體）。培養箱中培養至密度達70%的足細胞用質粒和轉染試劑（溶液1：150μL優化液+9μL脂質體3000；溶 液2：150 μL 優 化 液+1 μg pGL3-Basic-pim-1-promotor+1 μg 質粒+1 μg pRL-TK vector +6 μL P3000）進行轉染，裂解細胞后，依次加入螢火蟲熒光素酶檢測試劑和Renilla 熒光素酶檢測試劑，用酶標儀進行檢測，將螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性比值作為最終的細胞熒光素酶活性。

1.8 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。計量資料采用±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析或welch 檢驗，組間多重比較行LSD-t或Dunnett T3檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 沉默C∕EBPβ 表達后足細胞C∕EBPβ 水平的變化 Control 組、siRNA-NC 組及siC∕EBPβ 組C∕EBPβ mRNA 水 平 分 別 為1.00±0.03、1.04±0.01 和0.25±0.03，差異有統計學意義（F=1 298.073，P＜0.01）；3組C∕EBPβ 蛋白水平分別為1.00±0.00、1.01±0.01、0.31±0.01，差異有統計學意義（F=16 886.645，P＜0.01）；與Control 組和siRNA-NC 組相比，siC∕EBPβ組C∕EBPβ mRNA 和蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），Control組與siRNA-NC組C∕EBPβ mRNA和蛋白表達水平差異無統計學意義，見圖1。

Fig.1 C∕EBPβ protein level in glomerular podocytes圖1 Western blot檢測C∕EBPβ蛋白表達

2.2 沉 默C∕EBPβ 表 達 后 足 細 胞NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β 蛋白及炎性因子水平比較 Western blot 顯示，與Control 組相比，LPS+ATP組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與LPS+ATP+siRNA-NC 組相比，LPS+ATP+siC∕EBPβ 組 NLRP3、 p20Caspase-1、p17IL-1β 蛋白表達水平降低（P＜0.01），見圖2，表2、3。ELISA 結果顯示，與Control 組相比，LPS+ATP組IL-1β、IL-6 水平明顯升高；與LPS+ATP+siRNANC 組相比，LPS+ATP+siC∕EBPβ 組IL-1β、IL-6 水平明顯下降（P＜0.01），見表2、3。

Fig.2 NLRP3,p20Caspase-1 and p17IL-1β detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β蛋白印跡圖

2.3 沉默C∕EBPβ 表達后足細胞pim-1 水平的變化 qPCR 結果顯示，Control 組、siRNA-NC 組及siC∕EBPβ 組pim-1 mRNA 水平分別為1.00±0.08、0.95±0.03、0.36±0.03，差異有統計學意義（F=137.063，P＜0.01）。與Control 組和siRNA-NC 組相比，siC∕EBPβ組的pim-1 mRNA 水平明顯下降（P＜0.05）；與Control組相比，siRNA-NC組pim-1 mRNA水平未見明顯變化。

2.4 C∕EBPβ 與pim-1 基因啟動子結合 chip 結果顯示，與IgG 組相比，anti-C∕EBPβ 組有明顯的條帶，見圖3。雙熒光素酶報告基因實驗顯示C∕EBPβ-OE組熒光素酶活性較Control組明顯升高（2.27±0.03vs.1.00±0.11，t=6.805，P＜0.01）。

Fig.3 Detection of the relationship between C∕EBPβ and pim-1圖3 chip實驗檢測C∕EBPβ與pim-1結合

2.5 上調pim-1后足細胞pim-1水平的變化 Control、Vector-NC 和pim-1-OE 組pim-1 mRNA 水 平 為1.00±0.05、1.05±0.11、6.99±0.73，差異有統計學意義（F=82.880，P＜0.01）。與Control 組和Vector-NC 組比較，pim-1-OE組pim-1 mRNA水平明顯升高（P＜0.05）；與Control 組比較，Vector-NC 組pim-1 mRNA水平無明顯變化。

Tab.2 Comparison of expression levels of NLRP3,p20Caspase-1,p17IL-1β and inflammatory factors between the Control group and the LPS+ATP group表2 Control組和LPS+ATP組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β蛋白及炎性因子表達水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of NLRP3,p20Caspase-1,p17IL-1β and inflammatory factors between the Control group and the LPS+ATP group表2 Control組和LPS+ATP組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β蛋白及炎性因子表達水平比較（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別Control組LPS+ATP組t NLRP3 1.00±0.00 3.82±0.01 488.438＊＊p20Caspase-1 1.00±0.00 4.90±0.03 237.005＊＊p17IL-1β 1.00±0.00 4.32±0.56 10.322＊IL-1β（ng∕L）38.93±6.45 155.62±20.35 9.468＊＊IL-6（ng∕L）15.82±1.97 64.83±7.35 11.147＊＊

Tab.3 Comparison of expression levels of NLRP3,p20Caspase-1,p17IL-1β and inflammatory factors between the LPS+ATP+siRNA-NC group and the LPS+ATP+siC/EBPβ group表3 LPS+ATP+siRNA-NC組和LPS+ATP+siC/EBPβ組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β蛋白及炎性因子表達水平比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of expression levels of NLRP3,p20Caspase-1,p17IL-1β and inflammatory factors between the LPS+ATP+siRNA-NC group and the LPS+ATP+siC/EBPβ group表3 LPS+ATP+siRNA-NC組和LPS+ATP+siC/EBPβ組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β蛋白及炎性因子表達水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

組別LPS+ATP+siRNA-NC組LPS+ATP+siC∕EBPβ組t NLRP3 3.90±0.01 2.73±0.01 176.000＊＊p20Caspase-1 5.06±0.05 2.44±0.10 40.448＊＊p17IL-1β 4.02±0.05 2.01±0.02 67.265＊＊IL-1β（ng∕L）151.08±16.67 73.28±12.13 6.534＊＊IL-6（ng∕L）66.32±11.73 31.73±5.29 4.656＊＊

2.6 沉默C∕EBPβ 表達且上調pim-1 表達后足細胞NLRP3 炎性小體及炎性因子水平的變化 Western blot 結果顯示，與LPS+ATP+siC∕EBPβ+Vector-NC 組相 比，LPS+ATP+siC∕EBPβ+pim-1-OE 組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β、GSDMD 蛋白水平均明顯升高（P＜0.01），見圖4、表4。ELISA結果顯示，LPS+ATP+siC∕EBPβ+Vector-NC 組、LPS+ATP+siC∕EBPβ+pim-1-OE 組IL-1β 水平分別為（65.28±11.28）ng∕L、（99.21±10.71）ng∕L，IL-6水平分別為（35.53±5.16）ng∕L、（50.57±5.78）ng∕L，與LPS+ATP+siC∕EBPβ+Vector-NC組相比，LPS+ATP+siC∕EBPβ+pim-1-OE 組IL-1β 和IL-6水平升高（t分別為3.710和3.360，P＜0.05）。

Fig.4 NLRP3,p20Caspase-1,p17IL-1β and GSDMD protein levels in glomerular podocytes圖4 Western blot檢測NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β和GSDMD蛋白表達

Tab.4 Comparison of protein levels of NLRP3,p20Caspase-1,p17IL-1β and GSDMD between the two groups表4 2組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β和GSDMD蛋白表達比較 （n=3，±s）

Tab.4 Comparison of protein levels of NLRP3,p20Caspase-1,p17IL-1β and GSDMD between the two groups表4 2組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β和GSDMD蛋白表達比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

組別LPS+ATP+siC∕EBPβ+Vector-NC組LPS+ATP+siC∕EBPβ+pim-1-OE組t NLRP3 1.00+0.00 2.37±0.15 15.497＊＊p20Caspase-1 0.95±0.01 3.16±0.05 81.727＊＊p17IL-1β 0.94±0.02 2.08±0.02 66.679＊＊GSDMD 1.05±0.02 1.78±0.01 69.570＊＊

3 討論

NLRP3 炎性小體在LN 發病機制中可發揮重要作用［4］，其通過識別多種病原體導致p20Caspase-1活化，一方面裂解GSDMD，誘導細胞破裂，另一方面切割p17IL-1β和IL-6的前體，轉化為活性的p17IL-1β 和IL-6，引起炎癥反應［9-11］。研究發現Nlrp3-R258W突變小鼠會出現更嚴重的狼瘡樣綜合征，該小鼠NLRP3 炎性小體的過度激活可導致蛋白尿及腎臟免疫復合物沉積［12］。LN 患者中可見足細胞上的NLRP3炎性小體表達上調，NLRP3炎性小體的抑制劑可改善小鼠的蛋白尿［5］。另外，抑制MLR∕lpr小鼠NLRP3∕ASC∕p20Caspase-1 軸可減少炎性因子釋放，從而改善腎臟炎癥［13］。這些研究表明NLRP3炎性小體的激活可引起LN患者的足細胞損傷，但其上游調節因子尚不清楚。本研究發現沉默C∕EBPβ 表達后足細胞上的pim-1、NLRP3 炎性小體（NLRP3、p20Caspase-1）、p17IL-1β、IL-6水平下降，進一步研究發現C∕EBPβ可與pim-1啟動子結合，另外當沉默C∕EBPβ 表達且上調pim-1 表達后可使足細胞上的NLRP3 炎性小體及炎性因子水平升高，說明C∕EBPβ∕pim-1∕NLRP3 軸在足細胞損傷中發揮重要作用，且C∕EBPβ是pim-1的上游調節因子。

C∕EBPβ 可 以 調 節p20Caspase-1 及IL-6 的 表達［14-15］。C∕EBPβ-∕-小鼠腹膜巨噬細胞中NLRP3炎性小體表達下調［16］。敲除C∕EBPβ 可以減少小鼠心肌成纖維細胞IL-8 及IL-6 的釋放［17］。在急性腎損傷小鼠中，C∕EBPβ 通過激活NLRP3∕p20Caspase-1 信號軸引起腎小管上皮細胞焦亡［18］。在局灶節段性腎小球硬化癥中，C∕EBPβ 可通過激活較長的非編碼RNALOC105374325 的表達引起足細胞凋亡［19］。另外SLE患者外周血單核細胞中C∕EBPβ的表達上調，且與SLE 的疾病活動性有關［8］。關于C∕EBPβ 在足細胞損傷中的作用尚不明確。本研究發現，LPS+ATP 刺激足細胞后NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β及IL-6 水平明顯升高，但沉默C∕EBPβ 表達后可抑制LPS+ATP 誘導的NLRP3 炎性小體及炎性因子表達，表明LPS+ATP可引起足細胞上的NLRP3炎性小體激活，且C∕EBPβ 可通過NLRP3∕p20Caspase-1 信號軸參與足細胞損傷。

pim-1 屬于Ca2+∕鈣調蛋白依賴性蛋白激酶，最初研究表明其與惡性腫瘤及肺動脈高壓的發病有關［20-21］。Fu 等［6］發現pim-1 在SLE 小鼠腎臟組織和LN患者外周血單核細胞中表達上調，并可通過細胞內Ca2+調節NLRP3 炎性小體的激活，且pim-1 抑制劑可減輕LN患者的蛋白尿狀況。在本研究中，沉默C∕EBPβ 表達后pim-1 的mRNA 水平下降，提示C∕EBPβ 與pim-1 相互作用。chip 實驗和雙熒光素酶報告基因實驗證明C∕EBPβ 可與pim-1 基因啟動子結合，前者可調節后者的轉錄。進一步研究發現沉默C∕EBPβ 表達且上調pim-1 表達后，足細胞上的GSDMD、NLRP3 炎性小體、p17IL-1β 及IL-6 水平明顯升高，說明pim-1 可激活NLRP3∕p20Caspase-1 軸引起足細胞損傷，而且這種機制是通過C∕EBPβ介導pim-1來實現的。

綜上所述，C∕EBPβ∕pim-1∕NLRP3軸可能參與足細胞損傷。但本研究未探討上調足細胞C∕EBPβ 表達是否可引起NLRP3 炎性小體及炎性因子水平升高，且僅在細胞水平探討了C∕EBPβ∕pim-1∕NLRP3軸在足細胞損傷中的作用，尚待動物實驗和臨床研究進一步驗證。