單細胞測序技術在淋巴瘤中的應用研究進展

司君齊，袁田，李世俊，田晨，△

單細胞測序（single cell sequencing，SCS）技術是在單個細胞水平上對基因組、轉錄組、表觀組進行高通量測序分析的一項新技術。相較于代表一群細胞平均基因表達水平的傳統測序，如大量RNA 測序（bulk RNA-seq）［1-2］，SCS 能夠揭示單個細胞的基因結構和基因表達狀態，反映細胞間的異質性［3］。SCS通過檢測單個細胞基因組與轉錄組的差異，進而對其聚類，可鑒定出傳統測序技術檢測不到的罕見或新型細胞亞群。近年來，隨著測序成本的降低，SCS技術越來越受到關注，特別是在血液腫瘤研究方面。本文就近幾年SCS技術在淋巴瘤研究中的應用進展進行綜述，旨在為淋巴瘤的基礎研究提供新的思路。

1 SCS技術的基本原理

對于多細胞生物來說，不同組織細胞的基因表達往往具有顯著差異，即便是來源于同一組織，其組織內部各個細胞的異質性也很顯著，而腫瘤內存在的異質性是患者對抗腫瘤藥物耐藥的原因之一，這與其預后不良相關，是目前腫瘤治療面臨的巨大挑戰［4-6］。SCS技術則可全面而精確地分析腫瘤細胞基因組、轉錄組和表觀組，在單個細胞水平上對基因組或轉錄組進行擴增并測序，以檢測單核苷酸位點變異、基因拷貝數變異、單細胞基因組結構變異、基因表達水平、基因融合、單細胞轉錄組的選擇性剪切及單細胞表觀基因組的DNA 甲基化狀態等［7-8］。SCS主要包括以下幾個步驟：（1）標本采集。（2）單細胞懸液制備。（3）單細胞捕獲。（4）文庫構建。（5）測序。（6）生物信息學和統計分析［9-10］。

2 SCS技術的分類

SCS 包括一組功能強大且全面的技術，在過去的幾年中，已經開發了多種SCS方法，包括全外顯子組測序（scWES）、全轉錄組測序（scRNA-seq）、全基因組測序（scWGS）、全DNA 甲基化測序（scM-seq）、單細胞V（D）J 測序、轉座酶可接近性核染色質區域測序（scATAC-seq）等［11］，上述測序方法各具特點和優勢，可以從不同維度、不同層面獲得不同階段的細胞特征性信息。scWGS可用于單核苷酸變異和拷貝數異常的篩選；scATAC-seq主要用于分析單個細胞染色質可及性［12-13］；scRNA-seq 代表了目前最成熟的SCS 方法，可用于細胞類型鑒定、細胞狀態分析、基因標記、通路分析、表達亞型分析、腫瘤譜系推斷和細胞類型特異性差異表達分析等［14-15］。

3 SCS技術在淋巴瘤中的應用

3.1 霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL） HL是一種來源于B 淋巴細胞的罕見腫瘤，由腫瘤細胞與大量非腫瘤炎性細胞和（或）纖維化組織混合構成［16-17］。其主要分為2大類：經典型HL以及結節性淋巴細胞為主型HL［18］。Aoki 等［19］對來自22 個HL患者淋巴結活檢標本和5個反應性淋巴結切檢標本的超過12.7 萬個細胞進行了scRNA-seq，首次在單細胞尺度下描繪了HL 特異性免疫微環境的表型。該研究利用單細胞表達譜鑒定出一種新的HL 相關調節性T 細胞亞群，該亞群高表達抑制性受體LAG3，功能分析證實這種LAG3+T 細胞是免疫抑制的中介；進一步對微環境中免疫細胞的多重空間評估也顯示，主要組織相容性復合體Ⅱ類基因（MHC-Ⅱ）表達缺失的腫瘤細胞附近LAG3+T 細胞增加，MHC-Ⅱ是LAG3 的主要配體之一，通過MHC-Ⅱ和LAG3的相互作用，使得LAG3+T細胞受到負性調控。該研究結果有助于探索HL 腫瘤微環境及免疫逃逸機制、研發靶向治療藥物。

3.2 非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）

3.2.1 T細胞淋巴瘤 T細胞淋巴瘤占NHL的10%~15%。成熟（胸腺后或外周）T 細胞起源的腫瘤統稱為外周T 細胞淋巴瘤（peripheral T cell lymphoma，PTCL）。T 細胞淋巴瘤主要包括間變大細胞淋巴瘤（anaplastic cell lymphoma，ALCL）、皮膚T 細胞淋巴瘤（cutaneous T cell lymphoma，CTCL）、輔助性濾泡T細胞淋巴瘤（helper follicular T cell lymphoma，TFH）以及腸病相關T 細胞淋巴瘤（enteropathy-associated T cell lymphoma，EATL）等［18］。Borcherding 等［20］對1例Sézary綜合征患者的惡性和非惡性CD4+細胞進行scRNA-seq 和單細胞V（D）J 測序分析后發現，FOXP3+T細胞可轉化為GATA3+或IKZF2+（HELIOS）腫瘤細胞，從而參與克隆演化過程。Sézary 綜合征是CTCL 的一種特殊亞型，因此，FOXP3被認為是預測CTCL 早期和晚期疾病狀態的重要因素。在另一項研究中，Gaydosik 等［21］對5例CTCL 晚期患者和4例健康捐贈者的14 056 個CD3+淋巴細胞進行了scRNA-seq，發現晚期CTCL皮膚存在較大的腫瘤間和腫瘤內異質性，并證實了增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、ATP5C1、核仁紡錘體相關蛋白（nucleolar spindle-associated protein1,NUSPA1）和TOX 基因在CTCL 晚期患者的淋巴細胞中高表達，該研究確定了腫瘤特異性分子標志，對腫瘤的診斷和個性化治療具有重要意義。Li 等［22］通過對1例皮下脂膜炎樣T細胞淋巴瘤（subcutaneous panniculitis-like T cell lymphoma，SPTCL）患者的病變組織進行scRNA-seq 后定義了惡性細胞及免疫細胞亞群，該研究發現SPTCL 惡性細胞表達某些正常免疫細胞不存在的基因特征，包括趨化因子家族、細胞毒性蛋白、T細胞免疫檢查點分子和免疫球蛋白家族，并通過與正常T細胞比較，進一步發現惡性細胞中特異性表達潛在的SPTCL新標志物，如細胞骨架RNA（cytoskeleton regulator RNA，CYTOR）、趨化因子CXC 配體-13（chemokine CXC ligand13，CXCL13）、血 管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和T 細胞免疫球蛋白黏蛋白域-4（T-cell immunoglobulin and mucin domain 4，TIDM4）。

3.2.2 B 細胞淋巴瘤 B 細胞淋巴瘤可出現在B 細胞正常發育的任何階段，但大多數源于生發中心的細胞，主要包括彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）、濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）、套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）、華氏巨球蛋白血癥（Waldenstr?m's macroglobulinemia，WM）等［18］。

DLBCL是NHL中最常見的組織學亞型，常呈侵襲性，占NHL 的30%~58%［23］。DLBCL 的發病機制較為復雜，主流觀點認為是由生發中心或生發中心外B細胞惡性克隆的轉化和擴增導致［24］。Park等［25］對6例難治性DLBCL和7例反應性DLBCL患者的淋巴瘤樣本進行了scWES 和scRNA-seq，發現編碼區中致病性體細胞單核苷酸變異和插入缺失在難治性患者與反應性患者中無明顯差異；3例難治性患者中出現TP53 的錯義突變，且TP53 的所有錯義突變都伴隨著拷貝數缺失；難治性患者中MYD88、B2M、SORCS3 和WDFY3 突變較反應性患者更常見。該表達譜揭示了與治療抵抗相關的基因，有助于抗腫瘤藥物的研發。

FL是NHL 中第2常見的類型，其發病是一個復雜、多階段的過程，常呈惰性表現［26］。Andor等［27］利用scRNA-seq分析了6例原發FL患者淋巴結活檢組織的34 188 個細胞的轉錄組，將其分為8 個造血譜系，分別包括B 細胞譜系、單核細胞譜系、自然殺傷細胞譜系、CD4+記憶細胞譜系、調節性T 細胞譜系、CD4+初始細胞譜系、CD8+記憶細胞譜系及CD8+初始細胞譜系。隨后，Andor又根據基因表達水平確定了正常免疫亞群和惡性B 細胞亞群，通過比較來自同一患者的惡性B 淋巴細胞和正常B 細胞基因，發現惡性B 淋巴細胞免疫球蛋白輕鏈（Igκ 或Igλ）表達下調，B 細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2）基因表達上調，低親和力免疫球蛋白E 受體2（low-affinity IgE receptor，FCER2）、CD52以及MHC-Ⅱ表達下調。該團隊還發現多個惡性FL細胞亞克隆共存，并發現CD4+調節性T 細胞（Treg）中已知的免疫檢查點基因與轉錄因子和免疫調節因子（包括CEBPA 和B2M）共表達，且該結果與流式細胞術的結果一致，進一步驗證了scRNA-seq在看似均一的細胞中識別不同細胞亞群的能力。該研究有助于更好地了解腫瘤的免疫微環境，從而推動免疫治療的發展［28］。

MCL是NHL的一種罕見亞型，異質性及復發率高［29］。Wang等［30］對1例耐多藥的MCL患者約4 000個骨髓細胞進行了scRNA-seq，共鑒定了10 個亞群，其中包括4 個惡性B 細胞簇，3 個T 細胞簇，2 個樹突狀細胞簇和1 個NK 細胞簇。該研究揭示了MCL 中由Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型B 細胞介導的免疫逃逸機制：抗穿孔素活性、降低免疫原性、直接抑制凋亡和細胞殺傷。一方面，BCL2 家族成員（Ⅰ型B 細胞中的MCL1 和Ⅲ型B 細胞中的BCL2 L12）的過表達可以抑制穿孔素表達，減少癌細胞的損傷，高表達HSP90AA1 進一步促進了BCL2 L12 的表達；另一方面，MCL 惡性細胞中MHC-Ⅰ基因（包括HLA-A、HLA-B和HLA-C）的缺失導致MHC的缺失，從而避免了Ⅰ型、Ⅱ型T細胞的識別。此外，含桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復序列蛋白5（baculoviral inhibitor of apoptosis protein repeat-containing protein 5，BIRC5）、染色質解旋酶DNA 結合蛋白2（chromodomain helicase DNA-binding protein 2，CHD2）和PCNA在Ⅲ型B細胞中高表達。BIRC5和CHCHD2抑制細胞凋亡，而PCNA 抑制NK 細胞的殺傷作用，抑制細胞凋亡和細胞殺傷是惡性腫瘤的另一種潛在免疫逃逸機制，上述發現將對抗癌藥物的研發起推動作用。

WM是一種罕見的B淋巴細胞增殖性疾病，表現為骨髓中的淋巴漿細胞性淋巴瘤（lymphoplasmacytic lymphoma，LPL）伴血液中IgM 型單克隆丙種球蛋白病，其細胞成分包括惡性淋巴細胞和漿細胞［31-32］。Treon 等［33］收集了30例WM 患者的骨髓LPL 細胞進行scWGS 發現,MYD88 L265P 復發突變在WM 患者中較常見，該突變存在于90%以上的WM 或非IgM型LPL患者的腫瘤標本中。MYD88 L265P的存在有助于將WM 和非IgM LPL 與其他具有相同特征的B細胞疾?。ㄈ邕吘墔^淋巴瘤和多發性骨髓瘤）區分開來，并深入了解WM 的發病機制［34］。但MYD88 L265P信號通路能否應用于靶向治療仍有待觀察。

4 小結與展望

與傳統的腫瘤整體分子表型分析相比，SCS 具有更大的優勢，其可以對腫瘤患者的單個癌細胞進行分析，在研究腫瘤內異質性、化療耐藥性、腫瘤的演進等方面有較大的優勢，具有實現癌癥精準治療的強大潛力［35］。盡管目前的SCS技術仍有一些問題尚未解決，如耗時長，費用高，存在尚無法避免的技術誤差（如有效細胞的破壞或丟失、覆蓋率低、測序結果偏倚、錯誤率高、通量有限），樣本要求高等［14，36］。但隨著新技術的發展，SCS 的檢測時間將會縮短，費用將會降低，而測序的靈敏度和特異度也會不斷提高?；趩渭毎降姆肿颖硇头治鲇型麘糜谂R床。