皮質前額葉和海馬PPAR-α通路參與N-棕櫚酰乙醇胺抗大鼠抑郁樣行為

李瑞瑞，張露文，張渺，于海玲

抑郁癥是一種以顯著而持久的情緒低落為臨床特征的精神障礙，預計到2030年將成為全球第一大疾病負擔［1］。目前，以選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑為代表的新型抗抑郁藥為臨床主要用藥，但存在起效慢、臨床治愈率低、不良反應較多等缺點［2］。內源性大麻素系統由內源性大麻素、內源性大麻素受體及與其合成相關的代謝酶類組成，參與調節情緒、記憶、認知、植物神經系統和自主活動等神經活動進程［3-4］。研究表明，內源性大麻素系統的功能障礙會促進焦慮和抑郁等精神疾病的發生，皮質前額葉（prefrontal cortex，PFC）和海馬分泌的內源性大麻素可防止應激誘導的行為改變，產生抗焦慮和抗抑郁作用［5-7］。N-棕櫚酰乙醇胺（N-palmitoylethanolamide，PEA）是內源性大麻素類似物，為過氧化物酶體增殖物 激 活α受 體（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）的內源性激動劑，具有抗炎、鎮痛、神經保護等活性，在抑郁動物模型中已表現出抗抑郁和抗焦慮樣作用［8-9］。有研究證明，PEA可改善小鼠的疼痛和認知障礙，而在PPARα基因敲除小鼠中上述作用大多消失［10］。本實驗室前期研究發現，PEA可改善海馬組織內部分氧化應激因子的異常表達，上調PFC 的突觸素表達，使海馬和PFC 內PPARα 表達恢復正常，從而減輕大鼠抑郁樣行為［9，11］。本研究旨在進一步探究PEA 通過PFC 和海馬的PPARα途徑發揮抗抑郁作用的可能機制，為抑郁癥的治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級健康雄性SD 大鼠50 只，體質量180~200 g，購自延邊大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（吉）2017-0003。大鼠自由攝食飲水，在自然光照、室溫（23±2）℃、相對濕度（55±5）%的清潔空調室飼養，嚴格遵循國家《實驗動物管理條例》。

1.1.2 實驗試劑 PEA（延邊大學藥學院提供，化學結構式見圖1）；鹽酸氟西汀分散片（百憂解，20 mg∕片，禮來蘇州制藥）；PPARα拮抗劑MK886（上海瀚香生物）；鼠源多唾液酸-神經細胞黏附分子（polysialic acid neural cell adhesion molecule，PSA-NCAM）抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG二抗（SIGMA）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋）；腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、膠質細胞源性神經營養因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和核轉錄因子（nuclear factor，NF）-κB酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒均購于南京森貝伽生物科技公司。

Fig.1 Structure of N-palmitoylethanolamide圖1 N-棕櫚酰乙醇胺結構式

1.1.3 實驗儀器 DW-40L262 醫用低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司），PRO200 勻漿器（美國PROScientific），TGL-16aR 高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠），DW-2102A酶聯免疫檢測儀（北京六一生物科技有限公司），BX53光學倒置顯微鏡（日本奧林巴斯）。

1.2 動物分組、模型制備及實驗流程 大鼠適應性飼養1周后，按照隨機數字表法分為正常對照組、模型組、氟西汀組、PEA 組和PEA+MK886 組，每組10 只。除正常對照組外，其余4 組每天上午8：00 均給予慢性不可預見性溫和應激（CUMS）和孤養應激，連續4 周。CUMS 干預1 周后開始灌胃給藥，劑量均為10 mg∕kg，PEA+MK886 組在PEA 灌胃后腹腔注射MK886（3 mg∕kg）。

除正常對照組外，其余每組每日接受以下2 種不同的CUMS：電擊足底20 次、5 ℃水中游泳5 min、45 ℃水中游泳5 min、禁食禁水18 h、50 ℃熱刺激10 min、潮濕墊料17 h、合籠飼養17 h、空籠17 h、45°傾斜鼠籠24 h、夾尾1 min、懸尾1 min、異物放置24 h、燈光閃爍和晝夜循環顛倒24 h 等。動物每相鄰2 d 接受刺激不重復，確保大鼠不能預測特定刺激的出現。

1.3 腦切片的制備及免疫組化染色檢測PSA-NCAM 表達水平 實驗第36 天，每組按照隨機數字表法取3 只大鼠，將大鼠麻醉后處死，用預冷的生理鹽水從左心室灌注到右心房，待流出液變清透后，繼續灌注4%多聚甲醛（0.1 mol∕L 的PBS配制，pH=7.4）進行組織固定。低溫下迅速取出全腦，于4%多聚甲醛溶液中固定12 h后進行石蠟包埋與切片。

石蠟切片于烘箱60 ℃烤片，60 min 后進行脫蠟和水化，二甲苯溶液沖洗2 次，15 min∕次，無水乙醇2 次，10 min∕次，95%和85%乙醇各1 次，5 min∕次，結束后PBS 洗滌3 次，5 min∕次，抗原熱修復。冷卻至室溫后PBS洗滌3次，5 min∕次，滴加適量內源性過氧化物酶阻斷劑覆蓋于組織表面，室溫放置15 min，PBS 洗滌3 次，5 min∕次。切片滴加PSA-NCAM 鼠源抗體（1∶150），4 ℃過夜。次日室溫放置30 min后滴加適量的反應增強劑，PBS 洗滌3 次，5 min∕次。滴加適量辣根過氧化物酶標羊抗小鼠IgG 抗體，室溫30 min，PBS 洗滌3 次，10 min∕次。滴加DAB顯色液，適時流水沖洗，蘇木素復染，自來水沖洗返藍后進行脫水，最后用中性樹膠進行封片。光學倒置顯微鏡下觀察并拍照，Image Pro Plus 6.0 軟件分析平均光密度值。

1.4 腦組織取樣本采集和ELISA 檢測 剩余大鼠于樣本采集前12 h 禁食不禁水，麻醉大鼠后快速取腦，在低溫操作臺上分別分離PFC 和海馬組織，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存待用。參照ELISA試劑盒說明書的步驟進行操作，根據標準品所得的標準曲線計算出大鼠PFC 中BDNF、GDNF 含量，及PFC 和海馬中TNF-α、IL-1β 和NF-κB 含量。BDNF、GDNF和IL-1β含量分別用ng∕g腦組織表示，NF-κB和TNFα含量用μg∕g腦組織表示。

1.5 統計學方法 采用SPSS 25.0 進行數據分析，采用GrapPad Prism 7.0 做圖。符合正態分布的計量數據采用均數±標準差（±s）表示，正常對照組、模型組、氟西汀組、PEA組間各指標比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法；PEA+MK886組和PEA組間各指標比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠PFC 和海馬中PSA-NCAM 蛋白表達水平比較 正常對照組的PFC、海馬DG區以及CA3區的PSA-NCAM 陽性免疫反應產物呈棕黃色顆粒，數量較多，排列密集，染色深，神經元胞核被染成藍色。與正常對照組相比，模型組的PSA-NCAM 陽性免疫反應產物排列稀疏、密度明顯降低，染色變淺，平均光密度顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，氟西汀組和PEA 組大鼠PFC 和海馬CA3 區PSANCAM免疫反應產物數量增多，顏色較深，平均光密度顯著增高（P＜0.05）。與PEA 組相比，PEA+MK886 組的PSA-NCAM 陽性免疫反應產物染色變淺，平均光密度降低（P＜0.05），見圖2~4。

2.2 各組大鼠PFC中BDNF 和GDNF 含量比較 與正常對照組相比，模型組大鼠PFC 中的BDNF、GDNF含量均顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，氟西汀組和PEA 組PFC 中的BDNF、GDNF 含量升高（P＜0.05）。與PEA 組相比，PEA+MK886 組PFC 中BDNF、GDNF的含量均顯著降低（P＜0.05），見表1。

2.3 各組大鼠PFC 和海馬中TNF-α、IL-1β 和NFκB含量比較 與正常對照組相比，模型組大鼠PFC和海馬中TNF-α、IL-1β 和NF-κB 含量均顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，氟西汀組和PEA 組大鼠PFC 中TNF-α、IL-1β 和NF-κB 含量均降低（P＜0.05）；與PEA 組相比，PEA+MK886組大鼠PFC 和海馬中TNF-α、IL-1β 和NF-κB 的含量均顯著增加（P＜0.05），見表2。

Fig.2 Immunohistochemical staining results of the expression of PSANCAM in prefrontal cortex of rats(×400)圖2 各組大鼠PFC中PSA-NCAM蛋白表達的免疫組化染色結果（×400）

Fig.3 Immunohistochemical staining results of the expression of PSA-NCAM in DG of hippocampus of rats(×400)圖3 各組大鼠海馬DG區PSA-NCAM蛋白表達的免疫組化染色結果（×400）

Fig.4 Immunohistochemical staining results of the expression of PSA-NCAM in CA3 of hippocampus of rats(×400)圖4 各組大鼠海馬CA3區PSA-NCAM蛋白表達的免疫組化結果（×400）

Tab.1 Comparison of the content of BDNF and GDNF in PFC tissue between the five groups表1 各組大鼠PFC中BDNF和GDNF含量的比較（n=7，ng∕g，±s）

Tab.1 Comparison of the content of BDNF and GDNF in PFC tissue between the five groups表1 各組大鼠PFC中BDNF和GDNF含量的比較（n=7，ng∕g，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與模型組比較，c與PEA組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組氟西汀組PEA組PEA+MK886組F t BDNF 410.95±35.63 179.19±66.76a 294.49±41.37b 346.64±86.37b 187.25±24.22c 19.362＊＊4.723＊＊GDNF 130.25±27.25 72.99±18.79a 158.60±46.26b 127.26±30.97b 79.38±20.94c 9.696＊＊3.622＊＊

3 討論

近年來，應激被認為是誘導抑郁癥等精神類疾病的主要因素之一。應激是指外界環境劇烈變化時，機體的生理和心理失衡而出現的精神、神經內分泌和免疫等方面的反應［12］。經CUMS刺激建立的抑郁動物模型，與人類抑郁癥的發病機制接近，已被廣泛應用于抑郁癥機制研究和藥物篩選，此模型主要以測量“快感缺失”來判斷模型是否成功［13］。本實驗室前期研究已證實，CUMS 誘導大鼠出現了行為異常和生理功能障礙，抑郁癥模型建立成功，經過28 d的PEA 治療后，大鼠的體質量增長，自發活動、蔗糖偏好率均明顯增加，表明大鼠的食欲和情緒有所改善、消化系統功能有所好轉，探索行為和自發活動性及好奇程度都有所改善，獎賞反應和快感提升［9，11］。本研究進一步探究PEA改善大鼠抑郁樣作用的機制。

PFC和海馬是與認知、情緒密切相關的腦區，兩者具有內在聯系，PFC 在聯想恐懼和獎勵學習的神經元回路中起著關鍵的調節作用，在慢性應激后PFC和海馬可能出現結構可塑性的改變，導致焦慮、抑郁情緒，認知改變等［14］。突觸是一種高特異性的細胞黏附結構，黏附分子和糖蛋白類在其形成、成熟和功能調節中起到重要作用。PSA-NCAM 是一種帶有唾液酸的特殊神經細胞黏附分子，在神經細胞黏附、軸突生長以及對神經元前體細胞的遷移等方面有重要作用。PSA-NCAM 與神經元的生長、發育和存活有密切聯系，同時PSA-NCAM 也參與了突觸的生長，突觸可塑性形成和維持過程［15］。本研究中，PEA 處理后PFC 以及海馬DG 和CA3 區的PSANCAM 蛋白表達較模型組均明顯增加。BDNF 和GDNF參與神經元的存活、分化和生長，在神經系統的生長過程中發揮營養和保護作用［16］。研究發現，抑郁癥患者BDNF 及GDNF 水平的下降可導致腦神經元損傷后修復、再生能力下降，進而影響5-羥色胺、多巴胺等神經遞質的合成及分泌，并影響抗抑郁藥的治療效果［17-18］。本課題組前期研究發現，PEA可以逆轉CUMS 誘導的海馬BDNF 和GDNF 水平的下調［11］。本次實驗中，PEA組PFC中BDNF和GDNF水平較模型組升高，提示PEA可促進神經元增殖、遷移、軸突生長和突觸形成，增加PFC和海馬的神經可塑性。

Tab.2 Comparison of TNF-α,IL-1β and NF-κB contents in PFC and hippocampus between the five groups表2 各組大鼠PFC和海馬中TNF-α、IL-1β和NF-κB含量比較 （n=7，±s）

Tab.2 Comparison of TNF-α,IL-1β and NF-κB contents in PFC and hippocampus between the five groups表2 各組大鼠PFC和海馬中TNF-α、IL-1β和NF-κB含量比較 （n=7，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與模型組比較，c與PEA組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組氟西汀組PEA組PEA+MK886組F t TNF-α（μg∕g）PFC 2.39±0.51 5.63±1.32a 3.73±1.31b 3.07±0.64b 5.66±1.44c 13.113＊＊4.334＊＊海馬4.21±1.47 7.77±1.29a 4.82±1.31b 5.22±0.69b 6.49±1.71c 11.416＊＊3.108＊＊IL-1β（ng∕g）PFC 606.74±167.74 1 124.45±308.49a 828.25±173.81b 811.45±251.78b 1 056.20±268.61c 5.862＊＊2.491＊海馬763.96±197.49 1 087.39±212.28a 896.43±157.26 818.94±177.27b 1 034.20±265.57c 3.989＊2.426＊NF-κB（μg∕g）PFC 8.29±4.17 23.12±5.89a 13.10±1.99b 11.74±5.34b 18.53±2.84c 13.405＊＊2.972＊海馬12.89±2.11 21.46±4.28a 14.01±2.94b 13.57±2.72b 18.94±3.27c 11.609＊＊3.344＊＊

研究發現，精神疾病患者的腦組織中有多種炎癥標志物高表達，腦內炎性細胞因子水平的增加可引起神經細胞損傷，這為抑郁癥的細胞因子學說提供了有力支持［19］。TNF-α 通過促使炎癥介質的迅速生成導致細胞因子的級聯放大效應，從而導致“瀑布效應”，是判斷炎癥反應的可靠指標［20］。IL-1β是炎癥反應調控中關鍵的炎性細胞因子，也是體內誘導炎癥作用較強的炎癥介質之一。NF-κB 參與免疫、炎癥、應激反應以及細胞增殖和凋亡等過程，它作為炎癥信號通路中的關鍵調節因子，常被視為調控炎癥反應的重要靶點［21-22］。本研究發現，CUMS誘導后大鼠PFC 和海馬中的TNF-α、IL-1β 和NF-κB含量出現升高，經PEA 干預后明顯下降，提示PEA可能通過抑制NF-κB 信號通路從而減少中樞神經系統TNF-α、IL-1β等的釋放，阻斷炎癥的級聯放大效應，從而減輕過度炎癥引發的PFC 和海馬中神經元損傷，緩解慢性應激大鼠的焦慮抑郁樣行為表型。

在采用選擇性PPARα拮抗劑MK886預處理后，PEA對大鼠生理功能和行為學的改善作用不同程度被消除，本實驗室前期研究結果顯示PEA 可以上調CUMS大鼠PFC和海馬中PPARα的蛋白和mRNA的表達［9，11］，進一步證實PEA改善CUMS大鼠的抑郁樣行為的機制可能與PPARα信號通路有關。

綜上所述，PEA 可通過調控PFC 和海馬的PPARα 通路，促進PFC 和海馬的神經元增殖、突觸形成，增加神經可塑性；同時可通過減少炎性細胞因子的分泌來減輕PFC 和海馬中神經元損傷，改善慢性應激大鼠的焦慮抑郁樣行為表型。