LncRNA PVT1通過競爭miR-149-5p上調(diào)CHI3L1并影響變應性鼻炎進展的研究

姜玉秋，唐橋斐，閆智永，張爽

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是個體受到過敏原刺激后，由IgE 介導的炎性疾病。在過去的十年中，我國鼻炎的發(fā)病率從11%升高至17%［1］。盡管鼻炎不是嚴重的疾病，但卻是多種疾病的并發(fā)癥，嚴重影響人們的生活質(zhì)量和工作效率［2］。長鏈非編碼RNA（LncRNAs）是長度＞200 個堿基的不編碼蛋白質(zhì)的RNA。研究表明LncRNA PVT1 參與多種炎性疾病進展［3］。LncRNA PVT1在過敏性哮喘時表達量增高，可通過靶向調(diào)節(jié)下游miRNA的表達加劇哮喘期間的炎癥反應并導致細胞屏障損傷，進而加速哮喘進展［4-5］，推測其可能與AR 發(fā)展也密切相關。MicroRNA（miRNA）是一類非編碼的小RNA，其結合至mRNA 的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）來調(diào)節(jié)基因表達［6］。課題組前期研究已經(jīng)證實，miR-149-5p 在AR小鼠鼻黏膜組織中表達減少，并通過靶向Notch1調(diào)控下游蛋白Foxp3和RORγt表達，影響調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）∕輔助性T細胞17（Th17）平衡，從而改善AR小鼠鼻部過敏癥狀［7］。幾丁質(zhì)酶-3 樣蛋白1（CHI3L1）屬于糖苷水解酶18 家族蛋白，與哮喘、關節(jié)炎、鼻炎等疾病密切相關［8-11］。在嗜酸性粒細胞型鼻竇炎中CHI3L1 的表達量升高，抗炎分子Clara細胞10 ku 蛋白（CC10）可通過降低CHI3L1 的表達達到抑制炎癥的作用，提示CHI3L1可作為嗜酸性粒細胞型鼻竇炎的新型分子標志［9］。本研究旨在探究LncRNA PVT1 作為內(nèi)源性競爭RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）通過競爭性結合miR-149-5p而上調(diào)靶基因CHI3L1在AR中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 5 周齡SPF 級BALB∕c 小鼠24 只，購自遼寧長生生物技術有限公司［合格證號：SCXK（遼）2020-0001］，于18~22 ℃、50%~60%濕度的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲食和飲水，適應性喂養(yǎng)1 周后進行后續(xù)實驗。人源性胚胎腎細胞株293T 購自上海中喬新舟生物科技有限公司。蘇木精、SYBR Green（Solarbio，中國），曙紅Y、miRNA 第一鏈cDNA 合成（加尾法）試劑盒（Sangon，中國），TRIpure（BioTeke，中國），BeyoRT ⅡM-MLV 反轉錄酶（碧云天，中國），全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒、ECL發(fā)光液、二抗羊抗兔IgG-HRP均購自中國萬類生物，CHI3L1抗體（Abclonal，中國）、PVDF 膜（Millipore，美國）、脫脂奶粉（伊利，中國），小鼠IgE、白細胞介素（IL）-5、腫瘤壞死因子（TNF）-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（中國聯(lián)科），熒光素酶檢測試劑盒（凱基，中國），慢病毒載體pLVXshRNA1（豐暉生物，中國），氫氧化鋁、卵白蛋白（OVA）購自阿拉丁（中國），LncRNA PVT1 沉默序列、引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 24 只BALB∕c 小鼠，采用隨機數(shù)字表法抽取6只作為對照組（不造模），余18只小鼠建立AR模型，采用隨機數(shù)字表法均分為模型組、空載體對照（AR+NC）組、LncRNA PVT1 沉默（AR+shPVT1）組，每組6 只。模型建立：在實驗開始第1、7、14 天腹腔注射500 μL 含有10 μg OVA和1 mg 氫氧化鋁的PBS 溶液（作為基礎致敏）；從第21~27天每天給予建模小鼠鼻飼20μL 含有500μg OVA 的PBS 溶液（激發(fā)致敏）。在實驗第22、24、26 天時，于OVA 激發(fā)前2 h 向AR+NC 組小鼠尾靜脈注射空載體慢病毒（109TU∕mL，100μL∕次）［12］，向AR+shPVT1組小鼠尾靜脈注射同等劑量的LncRNA PVT1干擾載體慢病毒，向模型組小鼠尾靜脈注射等體 積 的 PBS 溶 液。 LncRNA PVT1 沉 默 序 列 5'-CCCGGATGAAGAGAAGCTACGAACTTCAAGAGAGTTCGTA GCTTCTCTTCATCCTTTTT-3'。對照組小鼠給予等體積的PBS溶液。

1.2.2 行為學評分 于末次致敏20 min后，觀察并記錄各組小鼠流涕、鼻癢狀況和打噴嚏次數(shù)。流涕評分標準：流至前鼻孔計1分，超出前鼻孔計2分，涕流滿面計3分。鼻癢評分標準：輕搔鼻1~2次計1分，介于輕搔鼻和劇烈抓撓鼻面不止之間計2 分，劇烈抓撓鼻面不止計3 分。噴嚏評分標準：1~3個計1 分、4~10 個計2 分，11 個以上計3 分，以上3 項指標合計為總分，總分范圍1~9分，超過5分說明造模成功［13］。

1.2.3 HE染色觀察鼻黏膜組織形態(tài) 小鼠鼻黏膜組織采用4%多聚甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后制作切片，切片脫蠟至水后進行HE染色，切片脫水透明處理后中性樹膠封片；于光學顯微鏡下觀察鼻黏膜組織結構變化。

1.2.4 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測鼻黏膜組織中LncRNA PVT1、miR-149-5p 及CHI3L1 mRNA 表達 于慢病毒注射48 h 后腹腔注射過量的戊巴比妥鈉（150 mg∕kg）處死小鼠。取各組小鼠的鼻黏膜組織，提取總RNA，檢測RNA濃度和質(zhì)量，反轉錄為cDNA，采用SYBR Green 染料法進行Real time PCR。反應條件：94 ℃5 min；94 ℃10 s，60 ℃20 s，72 ℃10 s，40 個循環(huán)。根據(jù)結果的Ct 值采用2-ΔΔCt法分別計算LncRNA PVT1、miR-149-5p 及CHI3L1 mRNA 的相對表達量。qPCR引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.5 Western blot檢測鼻黏膜組織中CHI3L1蛋白表達 取鼻黏膜組織，加入RIPA裂解液冰上靜置5 min，4 ℃，12 000 r∕min，離心10 min，抽取上清液。BCA法測定蛋白濃度后進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），PVDF 膜轉印，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（1∶500）4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗（1∶5 000），37 ℃孵育45 min，洗膜后均勻撒上ECL化學發(fā)光液靜置5 min，轉入暗盒中，暗室進行曝光。將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer 軟件）分析目標條帶的光密度（OD）值，計算CHI3L1 蛋白的相對表達量。

1.2.6 ELISA 檢測血清中IgE、IL-5、TNF-α 的水平 于慢病毒注射后48 h 取各組小鼠眼眶靜脈血1 mL，分離管分離血清，按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，檢測各組小鼠血清中IgE、IL-5、TNF-α的水平，以標準品濃度為縱坐標，校準后的OD值為橫坐標，根據(jù)標準曲線計算出IgE、IL-5、TNF-α的水平。

1.2.7 雙熒光素酶實驗檢測LncRNA PVT1∕miR-149-5p∕CHI3L1 的靶向調(diào)控關系 根據(jù)文獻［14］及預測軟件RNAhybrid（https:∕∕bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de∕rnahybrid∕）的結合位點構建LncRNA PVT1 野生型（WT）和突變型（MT）熒光素酶報告載體，分別與miR-149-5p mimic 或NC mimic共轉染至293T 細胞。實驗分組如下：LncRNA PVT1-WT+NC mimic 組、LncRNA PVT1-WT+miR-149-5p mimic 組、LncRNA PVT1-MT+NC mimic 組、LncRNA PVT1-MT+miR-149-5p mimic 組。分別構建CHI3L1野生型和突變型熒光素酶報告載體，與miR-149-5p mimic共轉染至293T細胞，此外在上述共轉染細胞組額外增加LncRNA PVT1-WT 或LncRNA PVT1-MT 熒光素酶報告載體共轉染細胞。實驗分組如下：miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR WT 組、miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR MT 組、miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR WT+LncRNA PVT1 WT 組、miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR WT+LncRNA PVT1 MT 組。上述各組細胞培養(yǎng)48 h 后，收集細胞加入細胞裂解液，按照熒光素酶檢測試劑盒的操作分別加入各檢測試劑，使用酶標儀讀取各組細胞海腎和螢火蟲熒光強度，以海腎熒光值作為內(nèi)參，計算各組細胞熒光素酶活性的比值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，所有檢測實驗在相同條件下獨立重復3次，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 行為學評分 18 只造模小鼠均出現(xiàn)不同程度的流涕、鼻癢和打噴嚏，成功建立AR 模型。與對照組相比，模型組小鼠行為學評分明顯提高（P＜0.05）；與模型組比較，AR+NC 組行為學評分的差異無統(tǒng)計學意義，AR+shPVT1組行為學評分顯著降低（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Comparison of behavioral scores between the four groups圖1 各組小鼠行為學評分比較

2.2 組織病理學改變 對照組鼻黏膜組織結構清晰完整，未見炎性細胞浸潤；與對照組相比，模型組鼻黏膜組織厚度變薄，組織結構致密無序，2個表面的柱狀細胞層大部分減少或丟失淺染，有明顯的炎性細胞浸潤；AR+NC 組與模型組類似，表面的柱狀細胞層丟失，細胞排列散亂，組織結構有丟失，伴隨炎性細胞浸潤。與模型組比較，AR+shPVT1組鼻黏膜組織結構分層明顯，柱狀細胞數(shù)量恢復，層次清晰，染色分明，見圖2。

Fig.2 HE staining of mouse nasal mucosa in each group(×200)圖2 各組小鼠鼻黏膜組織HE染色（×200）

2.3 鼻黏膜組織中LncRNA PVT1、miR-149-5p 和CHI3L1表達水平比較 與對照組比較，模型組鼻黏膜組織中LncRNA PVT1 和CHI3L1 mRNA 表達升高，miR-149-5p mRNA 表達下降（P＜0.05）；與模型組相比，AR+shPVT1 組小鼠鼻黏膜組織LncRNA PVT1 和CHI3L1 mRNA 的表達水平降低，miR-149-5p 的表達升高（P＜0.05）；AR+NC 組和模型組鼻黏膜 組 織 中LncRNA PVT1、miR-149-5p、CHI3L1 mRNA 的表達差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；見表2。Western blot結果表明，與對照組相比，模型組鼻黏膜組織中CHI3L1 蛋白的表達升高（P＜0.05）；與模型組相比，AR+shPVT1 組小鼠鼻黏膜組織中CHI3L1 蛋白的表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

Tab.2 Relative mRNA expressions of LncRNA PVT1，miR-149-5p and CHI3L1 in nasal mucosal tissues in each group表2 各組小鼠鼻黏膜組織中LncRNA PVT1、miR-149-5p和CHI3L1 mRNA相對表達情況 （n=3，±s）

Tab.2 Relative mRNA expressions of LncRNA PVT1，miR-149-5p and CHI3L1 in nasal mucosal tissues in each group表2 各組小鼠鼻黏膜組織中LncRNA PVT1、miR-149-5p和CHI3L1 mRNA相對表達情況 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與AR+NC 組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組AR+NC組AR+shPVT1組F LncRNA PVT1 1.00±0.00 3.51±0.59a 3.58±0.63a 0.75±0.14bc 34.470＊＊miR-149-5p 1.00±0.00 0.31±0.06a 0.33±0.06a 0.71±0.16abc 41.684＊＊CHI3L1 1.00±0.00 3.12±0.56a 3.09±0.51a 1.83±0.37bc 18.164＊＊

Fig.3 Expression of CHI3L1 protein in mucosa of mice圖3 小鼠鼻黏膜組織CHI3L1蛋白的表達

2.4 血清中IgE、IL-5、TNF-α 的表達水平 ELISA結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠血清IgE、IL-5、TNF-α 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；AR+shPVT1組與模型組相比，血清IgE、IL-5、TNF-α水平均降低（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of serum IgE,IL-5 and TNF-α levels between the four groups of mice表3 各組小鼠血清IgE、IL-5、TNF-α水平比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of serum IgE,IL-5 and TNF-α levels between the four groups of mice表3 各組小鼠血清IgE、IL-5、TNF-α水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與AR+NC 組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組AR+NC組AR+shPVT1組F IgE（μg∕L）33.77±5.59 111.38±17.30a 105.46±16.30a 51.29±8.66bc 26.882＊＊IL-5（ng∕L）23.35±3.60 102.54±17.37a 96.96±15.66a 44.21±7.03bc 30.090＊＊TNF-α（ng∕L）54.61±9.17 227.49±37.36a 235.78±39.65a 103.26±16.70bc 29.465＊＊

2.5 LncRNA PVT1∕miR-149-5p∕CHI3L1 的靶向調(diào)控關系 RNAhybrid 數(shù)據(jù)庫顯示LncRNA PVT1 和miR-149-5p 以及miR-149-5p 和CHI3L1 之間存 在互補結合位點，見圖4。雙熒光素酶實驗結果顯示，與LncRNA PVT1-WT+NC mimic 組相比，LncRNA PVT1-WT+miR-149-5p mimic組的熒光素酶相對活性降低（P＜0.05），證實LncRNA PVT1 與miR-149-5p 存在靶向關系，見圖5A。miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR WT 組和miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR MT 組相比，熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），表明CHI3L1是miR-149-5p的靶基因。miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR WT+LncRNA PVT1-MT 組與miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR WT+LncRNA PVT1-WT 組相比，熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），證實LncRNA PVT1 通過競爭性結合miR-149-5p，上調(diào)miR-149-5p 靶基因CHI3L1 的表達，見圖5B。

3 討論

長期以來，非編碼RNA已被證明在多種人類免疫及炎性疾病中起重要作用，一些非編碼RNA已經(jīng)成為炎癥相關介質(zhì)的重要轉錄調(diào)節(jié)劑［15-16］。一項針對鼻炎患者鼻黏膜中LncRNA 表達譜的分析發(fā)現(xiàn)，與非過敏對照組相比，鼻炎患者鼻黏膜中存在76個差異表達的LncRNA，結合GO和通路分析表明這些差異表達的LncRNA 在多個與炎癥有關的通路中富集［15］。

miRNA 作為小分子非編碼RNA 參與各種細胞的生長、分化及代謝的進展［17-18］。有研究證實，在哮喘、過敏性鼻炎和特應性皮炎中存在特定的miRNA表達譜，并且一些miRNA有望成為過敏性疾病的生物標志及治療的主要靶點［19］。本課題前期研究已經(jīng)證明，在鼻炎小鼠模型中，miR-149-5p 可通過抑制其下游靶基因Notch1 的表達影響Treg∕Th17 細胞的免疫平衡，從而改善鼻炎小鼠的鼻部過敏癥狀［7］。Ma等［4］研究發(fā)現(xiàn)，過敏性哮喘中LncRNA PVT1的表達量增高，并通過調(diào)節(jié)下游靶向miRNA的表達加劇哮喘期間的炎癥反應，導致細胞屏障損傷，進而加速哮喘的進展；但LncRNA PVT1在鼻炎中的作用尚未見報道。本課題組前期通過在線生物信息學網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)LncRNA PVT1 與miR-149-5p 存在結合位點，因此推測LncRNA PVT1可能通過調(diào)節(jié)miR-149-5p而參與調(diào)節(jié)AR 的進展。本研究采用OVA 致敏建立AR小鼠模型，行為學評分結果表明模型組小鼠流涕和打噴嚏的次數(shù)明顯增多并伴有劇烈抓撓鼻面的行為，qPCR 檢測發(fā)現(xiàn)LncRNA PVT1 在小鼠鼻黏膜組織中的表達明顯升高，而miR-149-5p則顯著降低，因此本研究推測LncRNA PVT1可能加速鼻炎的發(fā)生。

Fig.4 The binding sites of LncRNA PVT1 with miR-149-5p and the binding sites of miR-149-5p and CHI3L1圖4 LncRNA PVT1和miR-149-5p結合位點及miR-149-5p和CHI3L1結合位點

Fig.5 The targeted regulation of LncRNA PVT1∕miR-149-5p∕CHI3L1圖5 LncRNA PVT1∕miR-149-5p∕CHI3L1的靶向調(diào)控關系

本研究發(fā)現(xiàn)，敲低LncRNA PVT1后鼻炎小鼠流涕和打噴嚏的頻率較模型組有所降低，小鼠鼻黏膜炎性反應減輕，上皮結構趨于完整。ELISA 檢測結果表明，LncRNA PVT1 低表達后血清IgE 和炎性細胞因子IL-5、TNF-α 水平降低，表明干預LncRNA PVT1表達對鼻炎小鼠的炎癥具有一定的緩解作用。ceRNA 是Salmena 等［20-21］于2011 年提出的非編碼RNA（ncRNA）和信使RNA（mRNA）之間的調(diào)節(jié)機制，LncRNA 可通過競爭性結合miRNA 來減輕miRNA 對靶基因的抑制作用。目前已在多個領域?qū)υ摍C制進行相關研究，如LncRNA MEG3 作為miRNA“海綿”競爭性結合miR-17，上調(diào)其靶基因RORγt 的表達，從而影響過敏性哮喘的炎性細胞平衡［22］。有文獻表明，由巨噬細胞、嗜中性粒細胞等細胞分泌的CHI3L1 在組織損傷、炎癥、組織修復和重塑中起到重要的作用［8］；此外，CHI3L1 在哮喘患者的血清和肺組織中表達升高，且CHI3L1的表達水平與鼻炎及哮喘疾病的嚴重程度相關［9，23］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型小鼠的鼻黏膜組織中CHI3L1 mRNA及蛋白的表達水平均顯著增加，敲低LncRNA PVT1的表達后CHI3L1 的表達水平明顯降低，并與miR-149-5p呈現(xiàn)相反趨勢。為了深入探究LncRNA PVT1、miR-149-5p 與CHI3L1 之間的相互作用機制，本課題組又通過雙熒光素酶實驗在細胞水平上驗證LncRNA PVT1 可能通過競爭性結合miR-149-5p 而促進CHI3L1的表達。

本研究發(fā)現(xiàn)，在AR 小鼠中高表達的LncRNA PVT1 可通過ceRNA 機制抑制miR-149-5p 的表達，進而導致CHI3L1的表達升高，鼻黏膜組織炎癥反應增加，因而在鼻炎中具有潛在的促炎性作用，LncRNA PVT1∕miR-149-5p∕CHI3L1 通 路 也有 望 成為鼻炎治療的新靶點。