黃芪多糖保護去卵巢大鼠成骨細胞功能活性的機制研究

翟鑫祥，董輝，王晶，王永祥

絕經后骨質疏松癥是指絕經后女性由于缺乏雌性激素所致的骨吸收增加、骨組織微結構改變、骨骼脆性增強且具有較高骨折風險的一種疾?。?］。絕經后骨質疏松癥所致骨折與外力所致骨折存在差異，前者不但愈合緩慢，而且愈合質量較差，還具有較高的畸形愈合風險［2］?？构俏账幬铩⒐歉杉毎偕夹g對絕經后骨質疏松癥療效顯著，而成骨細胞在骨重建過程中發揮重要作用［3-4］。黃芪多糖是黃芪的主要藥用活性成分之一，具有調節免疫力和抗病毒、抗衰老、抗腫瘤功效，對人骨髓間充質干細胞成脂分化功能和骨代謝有調節作用［5-6］，但有關黃芪多糖治療絕經后骨質疏松癥方面的研究報道較少。本研究旨在探討黃芪多糖預防絕經后骨質疏松癥的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 75 只SPF 級雌性3 月齡SD 大鼠，體質量（270±20）g，購自湖北天勤生物科技有限公司，許可證號SCXK（蘇）2017-0007。實驗場所為SPF級動物飼養房，溫度20~25 ℃、濕度50%~55%、人工光照12 h∕d，使用許可證號為SYXK（蘇）2017-0044，大鼠自由飲水和進食。本研究遵守3R原則，并通過醫院動物倫理委員會批準（20191019）。

1.2 主要試劑和儀器 鈣定試劑盒（上海捷門生物技術合作公司），全反式維甲酸（ATRA，上海信帆生物科技有限公司），Triton X-100、黃芪多糖、雌二醇（上海梵態生物科技有限 公 司），MTT Kit（Ybscience），堿 性 磷 酸 酶（alkaline phosphatase，ALP）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（武漢益普生物科技有限公司），骨形態發生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）ELISA 試劑盒（上海研謹生物科技有限公司），骨鈣素（bone gla protein，BGP）ELISA試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司），骨保護素（osteoprotegerin，OPG）ELISA試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司），兔抗鼠核因子E2 相關因子（nuclear factor E2 related factor，Nrf2）、醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1，NQO1）抗體（上海鈺博生物科技有限公司），兔抗鼠血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）抗體（kl584Mu01，上?？道噬锟萍加邢薰荆?-磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），GAPDH抗體（武漢菲恩生物科技有限公司），成骨誘導液（百致生物醫藥科技上海有限公司），PC201柱式動物組織∕細胞總蛋白抽提試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司）。多功能酶標儀（SpectraMax iD3，美國Molecular Devices），X 線小動物骨密度儀（Ultra Focus DXA，美國Faxitron）。

1.3 研究方法

1.3.1 骨質疏松癥模型大鼠制備及分組 參考文獻［7］，對60 只3 月齡雌性SD 大鼠行雙側卵巢切除術，制備骨質疏松癥模型。60只大鼠均造模成功，并按隨機數字表法分為模型組、陽性對照組（雌二醇組）、黃芪多糖組、黃芪多糖+ARTA組，每組15只；另取15只3月齡雌性SD 大鼠為假手術組，只進行卵巢周圍脂肪組織切除，不摘除卵巢。

1.3.2 藥物干預 術后1周，雌二醇組大鼠以雌二醇（0.1 mg∕kg）灌胃，黃芪多糖組以黃芪多糖（20 mg∕kg）灌胃［8］，黃芪多糖+ARTA組以黃芪多糖（20 mg∕kg）和ARTA（7 mg∕kg）灌胃［9］，模型組和假手術組以等體積生理鹽水灌胃；各組干預均1次∕d，連續8周。

1.3.3 大鼠脛骨骨密度、骨礦量和生物力學性質測定 末次給藥后24 h，隨機抽取8只大鼠，用X線小動物骨密度儀檢測各組大鼠脛骨骨密度、骨礦量；檢測后麻醉處死大鼠，分離右側脛骨，三點彎曲法［10］檢測脛骨生物力學性質（最大載量、斷裂能）。

1.3.4 BMSCs 分離、培養 分離大鼠股骨，并與1.3.3 中分離所得余下脛骨一起使用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗干凈，全骨髓貼壁培養法［11］進行BMSCs 培養、傳代和鑒定，取第3 代對數生長期細胞用于后續實驗。

1.3.5 MTT法檢測成骨細胞活性 將1.3.4中的BMSCs以細胞密度為2×104∕mL、100μL∕孔接種于96孔板，采用成骨誘導液連續誘導6 d，加入100μL 0.5 g∕L MTT溶液，孵育4 h，棄上清液，加入200μL DMSO孵育0.5 h，檢測波長570 nm處的光密度（OD）值。每組重復6次。

1.3.6 ALP 活性及鈣沉積量檢測 將1.3.4 中的BMSCs 以細胞密度2×105∕mL、250μL∕孔接種于24孔板，成骨誘導液連續誘導6 d，將細胞溶解于0.1% Triton X-100，采用Bradford 法檢測ALP 活性；成骨誘導28 d 時，鄰甲酚酞絡合酮法［12］檢測鈣沉積量。

1.3.7 成骨細胞中BMP2、BGP、OPG、SOD、MDA水平檢測 取經過1.3.5骨誘導6 d后的各組細胞，3 500 r∕min 離心20 min，取上清液，ELISA 檢測BMP2、BGP、OPG、SOD、MDA 水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。每組重復6次。

1.3.8 Western blot 檢測Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表達 提取BMSCs 成骨誘導液作用21 d 后的細胞總蛋白，使用Bradford法調整各組細胞蛋白濃度使其一致，依次經SDS-PAGE凝膠電泳、轉PVDF 膜、密封2 h，加入Nrf2、HO-1、NQO1、GAPDH一抗（均1∶500）4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記二抗（1∶500）孵育1 h，曝光顯影后，使用IMAGE J 圖像處理軟件分析蛋白條帶灰度值，統計條帶相對灰度值。每組重復6次。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0 和SigmaStat 4.0 軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠骨密度、骨礦量及生物力學性質比較 與假手術組比較，模型組大鼠骨密度、骨礦量、最大載量和斷裂能均降低（P＜0.05）；與模型組比較，雌二醇組、黃芪多糖組大鼠骨密度、骨礦量、最大載量和斷裂能均升高（P＜0.05）；與黃芪多糖組比較，黃芪多糖+ARTA組大鼠骨密度、骨礦量、最大載量和斷裂能均降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of bone mineral density,bone mineral content and biomechanical properties between the five groups of rats表1 各組大鼠骨密度、骨礦量及生物力學性質的比較（n=8，±s）

Tab.1 Comparison of bone mineral density,bone mineral content and biomechanical properties between the five groups of rats表1 各組大鼠骨密度、骨礦量及生物力學性質的比較（n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與模型組比較，c與黃芪多糖組比較，P＜0.05；表2-5同。

組別假手術組模型組雌二醇組黃芪多糖組黃芪多糖+ARTA組F骨密度（g∕cm3）0.33±0.02 0.21±0.02a 0.32±0.03b 0.29±0.03b 0.23±0.04c 27.429＊＊骨礦量（g）2.13±0.35 0.84±0.12a 1.83±0.23b 1.75±0.25b 1.27±0.18c 36.400＊＊最大載量（N）90.34±6.28 61.02±8.31a 83.43±5.67b 79.84±6.41b 69.61±6.07c 24.578＊＊斷裂能（mJ）24.93±3.26 11.09±2.52a 21.53±2.97b 18.36±2.72b 15.13±2.64c 28.975＊＊

2.2 各組大鼠成骨細胞活性、ALP 活性及鈣沉積量比較 與假手術組比較，模型組成骨細胞活性、ALP活性及鈣沉積量均降低（P＜0.05）；與模型組比較，雌二醇組、黃芪多糖組成骨細胞活性、ALP活性及鈣沉積量均升高（P＜0.05）；與黃芪多糖組比較，黃芪多糖+ARTA 組成骨細胞活性、ALP 活性及鈣沉積量均降低（P＜0.05），見表2。

2.3 各組大鼠成骨細胞中BMP2、BGP、OPG 水平比較 與假手術組比較，模型組BMP2、BGP、OPG水平均降低（P＜0.05）；與模型組比較，雌二醇組、黃芪多糖組BMP2、BGP、OPG 水平均升高（P＜0.05）；與黃芪多糖組比較，黃芪多糖+ARTA組BMP2、BGP、OPG水平均降低（P＜0.05），見表3。

2.4 各組大鼠成骨細胞中SOD、MDA水平比較 與假手術組比較，模型組SOD 活性降低，MDA 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，雌二醇組、黃芪多糖組SOD 活性升高，MDA 水平降低（P＜0.05）；與黃芪多糖組比較，黃芪多糖+ARTA 組SOD 活性降低，MDA水平升高（P＜0.05），見表4。

Tab.2 Comparison of osteoblast activity,ALP activity and calcium deposition between the five groups of rats表2 各組大鼠成骨細胞活性、ALP活性及鈣沉積量比較（n=6，±s）

Tab.2 Comparison of osteoblast activity,ALP activity and calcium deposition between the five groups of rats表2 各組大鼠成骨細胞活性、ALP活性及鈣沉積量比較（n=6，±s）

組別假手術組模型組雌二醇組黃芪多糖組黃芪多糖+ARTA組F成骨細胞活性（OD值）0.47±0.10 0.21±0.04a 0.42±0.04b 0.39±0.05b 0.30±0.03c 19.283＊＊ALP活性（U∕L）29.53±3.36 20.42±2.85a 28.69±3.01b 27.31±3.24b 23.36±2.80c 9.521＊＊鈣沉積量（μg∕g）106.92±5.28 52.36±4.85a 98.36±5.67b 87.36±6.31b 71.66±6.07c 88.663＊＊

Tab.3 Comparison of BMP2,BGP and OPG in osteoblasts between the five groups of rats表3 各組大鼠成骨細胞中BMP2、BGP、OPG水平比較（n=6，μg∕L，±s）

Tab.3 Comparison of BMP2,BGP and OPG in osteoblasts between the five groups of rats表3 各組大鼠成骨細胞中BMP2、BGP、OPG水平比較（n=6，μg∕L，±s）

組別假手術組模型組雌二醇組黃芪多糖組黃芪多糖+ARTA組F BMP2 10.47±1.53 6.36±1.04a 9.15±1.27b 8.68±1.18b 7.12±1.05c 10.673＊＊BGP 24.35±2.68 17.26±2.14a 22.39±2.15b 21.86±2.53b 18.94±1.08c 10.057＊＊OPG 6.92±1.05 2.21±0.54a 5.93±0.96b 5.36±1.03b 3.72±0.67c 27.360＊＊

Tab.4 Comparison of oxidation indexes in osteoblasts between the five groups of rats表4 各組大鼠成骨細胞中SOD、MDA水平比較（n=6，±s）

Tab.4 Comparison of oxidation indexes in osteoblasts between the five groups of rats表4 各組大鼠成骨細胞中SOD、MDA水平比較（n=6，±s）

組別假手術組模型組雌二醇組黃芪多糖組黃芪多糖+ARTA組F SOD（U∕L）41.56±6.35 16.31±4.19a 37.25±5.73b 38.72±6.24b 24.64±5.92c 21.130＊＊MDA（mmol∕L）10.53±1.39 31.63±3.63a 16.36±2.15b 11.31±1.52b 22.13±2.48c 81.222＊＊

2.5 各組大鼠成骨細胞中Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白相對表達水平比較 與假手術組比較，模型組Nrf2、HO-1、NQO1 相對表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，雌二醇組、黃芪多糖組成骨細胞Nrf2、HO-1、NQO1 相對表達水平升高（P＜0.05）；與黃芪多糖組比較，黃芪多糖+ARTA 組Nrf2、HO-1、NQO1 相對表達水平降低（P＜0.05），見圖1、表5。

3 討論

絕經后女性由于卵巢功能減退，雌激素水平減低，體內骨轉化率加快，導致絕經后骨質疏松癥［13］。構建動物模型探究絕經后骨質疏松癥的發病機制及防治措施為常用研究方法，其中去勢法是較為成熟、有效的建模方式。本研究結果顯示，在造模的同時給予大鼠黃芪多糖灌胃干預可以明顯改善其骨密度、骨礦量、最大載量及斷裂能，且其干預效果與雌二醇接近，表明黃芪多糖具有抗骨質疏松的作用，而使用Nrf2信號通路抑制劑ATRA處理后，骨密度、骨礦量、最大載量及斷裂能明顯低于黃芪多糖干預的大鼠，提示黃芪多糖可能通過介導Nrf2途徑來發揮抗骨質疏松作用。董重陽等［14］研究亦得到相近結論。

Fig.1 Relative expression levels of Nrf2,HO-1 and NQO1 in osteoblasts of each group圖1 各組大鼠成骨細胞中Nrf2、HO-1、NQO1相對表達水平

Tab.5 Relative expression levels of Nrf2,HO-1 and NQO1 in osteoblasts of each group表5 各組大鼠成骨細胞中Nrf2、HO-1、NQO1相對表達水平 （n=6，±s）

Tab.5 Relative expression levels of Nrf2,HO-1 and NQO1 in osteoblasts of each group表5 各組大鼠成骨細胞中Nrf2、HO-1、NQO1相對表達水平 （n=6，±s）

組別假手術組模型組雌二醇組黃芪多糖組黃芪多糖+ARTA組F Nrf2 0.91±0.13 0.13±0.02a 0.56±0.07b 2.37±0.28b 0.57±0.05c 216.640＊＊HO-1 0.71±0.18 0.16±0.03a 0.63±0.15b 2.86±0.31b 0.47±0.08c 220.846＊＊NQO1 0.82±0.15 0.08±0.02a 0.73±0.12b 2.16±0.23b 0.32±0.05c 210.460＊＊

骨形成和骨吸收之間的平衡是保持骨組織正常的關鍵所在。本研究結果顯示，絕經后骨質疏松癥大鼠BMSCs 的增殖活性、ALP 活性以及鈣沉積量較假手術組明顯降低，表明雌激素缺乏會增強破骨細胞活性，而抑制成骨細胞活性，雌二醇干預后成骨細胞活性、ALP活性以及鈣沉積量均增強，黃芪多糖干預結果與雌二醇干預結果相近，此結果與楊九杰等［15］部分研究結果趨勢相似。本研究中給予黃芪多糖+ATRA 干預后，大鼠成骨細胞增殖活性、ALP 酶活性以及鈣沉積量降低，進一步證實了黃芪多糖可能通過Nrf2 信號通路影響成骨細胞增殖活性，從而發揮抗骨質疏松的作用。

BMPs 作為骨基質中大量存在的轉化生長因子超家族的一員，主要促進未分化間充質細胞以及成纖維細胞向骨系細胞轉化，從而發揮促進骨折愈合的作用［16］。BGP 也稱為骨鈣蛋白，是反映骨形成的特異性生化指標，主要發揮維持骨正常鈣化速率、抑制軟骨的鈣化速度和抑制骨異常的作用，能夠直接反映骨質疏松患者體內骨細胞活性以及骨形成情況。OPG是由成骨細胞和骨髓間質細胞等分泌的一類多肽鏈，通過與破骨細胞分化關鍵因子結合，抑制骨吸收，從而增加皮質骨和松質骨密度，并提高骨強度。本研究結果顯示，模型組成骨細胞中BMP2、BGP、OPG 水平較假手術組降低，雌二醇、黃芪多糖干預后均可逆轉上述趨勢，但在黃芪多糖基礎上給予ATRA 干預又會改變這種趨勢，表明在小鼠體內BMP2被抑制時，會使成骨細胞的增殖及分化受到抑制，發生骨質疏松，BMP2 在骨質疏松的發生及發展中發揮重要作用，提示黃芪多糖能夠通過影響成骨細胞功能活性來發揮抗骨質疏松的作用。

正常生理情況下，機體內活性氧的產生及清除處于一種動態平衡的狀態，此時破骨細胞能夠產生適量的自由基產物加速組織鈣化，從而促進骨重建［17］。雌激素缺乏會抑制抗氧化酶活性，清除ROS的能力降低，破骨細胞產生的自由基產物會在細胞水平上產生一系列氧化損傷，抑制大部分細胞的分化、生長及增殖過程［18］。本研究結果顯示，絕經后骨質疏松癥大鼠成骨細胞中SOD活性降低，MDA水平升高，表明絕經后骨質疏松大鼠體內氧化應激反應較嚴重，而黃芪多糖干預可以逆轉上述趨勢，可能因為黃芪多糖本身就是一種有效的自由基清除劑［19］，能夠通過降低ROS水平，減輕ROS對SOD活性的抑制作用，同時減少過量ROS對脂膜的攻擊，從而降低MDA 水平。Nrf2是一種重要的抗過氧化反應蛋白，當機體產生氧化應激反應時，Nrf2 能夠迅速地磷酸化激活并轉移至細胞核中，通過作用下游ARE 蛋白，促進HO-1、SOD、NQO1 等抗氧化蛋白表達［20］。HO-1 作為Nrf2 的下游靶蛋白，可調節炎癥反應，減輕組織損傷［21］。NQO1 則是一類黃素蛋白酶，通過催化胞內雙電子還原反應，進而解除醌類物質的細胞毒性，從而發揮對細胞和器官保護作用［22］。本研究結果顯示，絕經后骨質疏松癥大鼠成骨細胞中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達水平較假手術組降低，黃芪多糖干預后的Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白相對表達水平均升高，表明黃芪多糖可能是通過激活Nrf2信號途徑，誘導抗氧化蛋白表達，從而改善絕經后骨質疏松大鼠的氧化應激反應，保護骨組織。

綜上所述，黃芪多糖可促進絕經后骨質疏松大鼠的抗氧化酶合成分泌、減輕氧化應激反應、增強成骨細胞功能活性，從而緩解骨質疏松，其作用機制可能與激活Nrf2信號通路有關。