ABCC2基因單核苷酸多態性對食管鱗癌術后患者無病生存期的影響

曹放，孫志偉，史幼梧，孫婧，杜豐，肖艷潔，余靖，賈軍，楊穎△

食管癌是嚴重威脅人類健康和生命的疾病。最新統計數據顯示，2015 年我國新發食管癌47.79 萬例，死亡37.5 萬例，位列癌癥發病第3 位，死亡第4位［1］。鱗狀細胞癌是食管癌主要的病理組織學類型，約占全部食管癌的90%［2］。食管鱗狀細胞癌預后較差，5年生存率不足20%［1-2］。目前多采用手術、放療、系統治療（如化療及免疫治療等）、介入治療以及射頻消融等多種治療手段，以期改善患者的生活質量，延長生存期。盡管外科技術不斷進步，且新輔助化療、輔助化療及圍手術期放化療等圍手術期治療方式日益完善，術后仍有28%~74%的患者復發［3］。探索術后患者復發的相關因素，可以為患者個體化治療，改善預后提供一定的依據。

一直以來，基因突變和基因多態性都是探索個體化治療和精準醫療的熱點。單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）是常見的基因變異形式，可能與癌癥的發生、發展及預后相關，是個體罹患疾病及生存差異的基礎。食管鱗癌患者的圍手術期治療多以紫杉醇為主。結合臨床實踐需要，參考已發表的研究結果，本研究以紫杉醇藥代動力學通路為基礎［4］，探討ATP 結合盒亞家族（ATP binding cassette subfamily，ABC）B 成員1（ABCB1）、ABCG2、ABCC1 及ABCC2 這4 個基因的SNP 對食管鱗癌患者術后無病生存期的影響，旨在為手術患者提供新的生物標志物以評估預后，并根據不同的復發風險進行個體化管理與治療。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2010年9月—2018年12月北京大學腫瘤醫院腫瘤內科VIP2 病區收治的227例食管鱗癌患者。排除晚期、未接受手術、未接受圍手術期治療或圍手術期未接受紫杉醇治療的患者，最終納入77例圍手術期接受紫杉醇治療的食管鱗癌根治術患者作為研究對象。鱗癌的診斷以術后的病理診斷為準。所有患者均簽署書面知情同意書，同意出于科學研究的目的，對其生物學樣本進行檢測并采集其醫療記錄進行分析。本研究得到了北京大學腫瘤醫院倫理委員會的批準（倫理批件號2016KT91）。

1.2 研究方法

1.2.1 研究設計及SNP選擇 本研究為預后研究，研究設計為回顧性隊列研究。采集患者靜脈血并保存在-92 ℃冰箱中。研究選擇的SNP 均來自美國國家生物技術信息中心SNP 數據庫（National Center for Biotechnology Information SNP database），符合以下條件的SNP最終被納入研究：（1）中國人群中次要等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）≥20%。（2）基因分型檢出率（genotying call rate）≥95%。（3）基因連鎖不平衡系數r2＜0.8。（4）優先選擇位于基因轉錄區域的錯義SNP，即基因外顯子區域，其次選擇同義SNP，最后是內含子SNP。最終7個SNP被確定為研究對象，即ABCB1 rs1045642、rs2032582、rs3213619，ABCG2 rs2231137、rs2231142，ABCC1 rs246221和ABCC2 rs3740066，見表1。

根據人群中基因分布頻率的不同，等位基因分為主要型（A）和次要型（a）；基因型分為主要等位基因純合型（AA）、雜合型（Aa）和次要等位基因純合型（aa）。Aa、aa 分別與AA 比較的方法，稱為基因加性模型；將雜合型及次要等位基因純合型之和（Aa+aa）與AA 比較的方法，稱為基因顯性模型；將aa與AA+Aa比較的方法，稱為基因隱性模型。

Tab.1 Characteristics of selected single nucleotide polymorphisms表1 納入研究的單核苷酸多態性的特征

1.2.2 基因測序分型 采用MassARRAYTMMaldi-tof 系統（Sequenom,Inc.）進行SNP基因測序分型。采用MassARRAYTMAssay Design 軟件設計聚合酶鏈反應（PCR）擴增的引物和單堿基延伸引物（表2），采用MassARRAYTMCompac 分析儀進行質譜檢測。約5%的樣本行重復檢測用于質量控制。

Tab.2 Primer sequence of selected single nucleotide polymorphisms表2 單核苷酸多態性基因測序的引物序列

1.2.3 收集指標 收集患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、食管病變位置以及是否為多原發病變等信息。無病生存期（disease-free survival，DFS）是指從根治術后到第一次復發或因任何原因導致死亡之間的時間。復發的確認以影像學診斷結合臨床實際為準。對復發患者的隨訪以門診訪視為主，同時結合電話及微信隨訪，所有復發的影像學報告均以紙質版形式存檔。

1.3 統計學方法 所有統計分析均采用SAS v9.4 軟件（SAS Institute Inc.，Cary，NC）進行。分別以遺傳加性模型、顯性模型和隱性模型進行SNP分析。首先應用比例風險回歸模型，即Cox回歸模型評估遺傳變異對無病生存的影響，然后校正年齡和性別行進一步分析。研究結果以粗風險比（crude hazard ratio，cHR）、校正風險比（adjusted HR，aHR）及其95%置信區間（CI）表示。多次檢驗和小樣本量可能導致研究結果假陽性，本研究采用半貝葉斯收縮方法（semi-Bayesian Shrinkage）進行調整和驗證［5］。由于缺乏生物機制研究，且流行病學證據有限，因此先驗系數選擇均值0、方差1.92的正態分布，即指數化后先驗HR=1.000，先驗95%CI為0.250~4.000。

2 結果

2.1 一般臨床特征 在本研究中，77例食管鱗癌術后患者年齡59（54，62）歲，男62例（80.5%）。52例（67.5%）有吸煙史，51例（66.2%）有飲酒史。10例（13.0%）為多原發病變，其余67例單發病灶患者中，3例（4.5%）位于食管胸上段，13例（19.4%）位于胸中段，51例（76.1%）位于胸下段。所有患者均接受了一種甚至多種圍手術期治療，包括新輔助治療38例（49.4%），輔助化療31例（40.3%），輔助放化療22例（28.6%）。術后64例（83.1%）患者復發，13例患者無復發（16.9%），中位DFS為368（194，776）d。

2.2 臨床特征對DFS的影響 將患者年齡（連續變量）、性別（男=0，女=1）、吸煙史（無=0，有=1）、飲酒史（無=0，有=1）、食管病變位置（胸下段=0，胸上中段=1）以及是否為多原發病變（否=0，是=1）等信息與SNP（加性模型：野生型=0，雜合型=1，純合型=2；顯性模型：野生型=0，其他=1；隱性模型：純合型=1，其他=0）作為自變量納入研究，以是否復發（無復發=0，復發或因任何原因導致死亡=1）為因變量，進行Cox 回歸分析。結果顯示，未發現性別、年齡、腫瘤位置及吸煙、飲酒史等與DFS有關，見表3。

2.3 SNP 對DFS 的影響分析 在顯性基因模型下，ABCC2 rs3740066的次要等位基因與DFS縮短有關。在校正性別和年齡后，該關聯仍有統計學意義［cHR（95%CI）=4.623（1.111~19.241），P=0.035；aHR（95%CI）=4.290（1.010~18.215），P=0.048］，即 含ABCC2 rs3740066 的次要等位基因T 的患者復發危險較野生型提高3倍以上。其他基因的SNP在各個基因模型下，以及ABCC2 rs3740066 在其他基因模型下，均未發現有統計學意義的關聯性。見表4。

Tab.3 Analysis of the influence of clinical characteristics on disease-free survival表3 臨床特征對無病生存期的影響分析

2.4 潛在假陽性結果的校正 多次檢驗和小樣本量可能導致假陽性結果，本研究采用半貝葉斯收縮對病例進行校正，在采用先驗假設［先驗HR=1.000，95%CI：0.250~4.000）］的前提下，經半貝葉斯收縮，在顯性模型下，與ABCC2 rs3740066野生基因型（CC型）比較，含次要等位基因T的基因型semi-BayesiancHR（95%CI）=2.171（0.828~5.692），P=0.115；semi-BayesianaHR（95%CI）=2.070（0.786~5.457），P=0.141。關聯差異無統計學意義。

3 討論

本研究探索了藥代動力學相關基因多態性對食管鱗癌術后DFS的影響，結果顯示，在食管鱗癌根治術后的患者中，顯性基因模型下ABCC2 rs3740066含次要等位基因的基因型與DFS 縮短有關，而未發現臨床因素，如性別、年齡、煙酒史以及食管原發腫瘤位置及數量等與DFS有關。

3.1 ABC 轉運蛋白家族與惡性腫瘤 在藥物代謝中，ABC轉運蛋白家族起到重要的作用，作為主動外排泵，其成員主動地將各種物質，包括氨基酸、多糖、肽、脂質、藥物和毒素轉運出細胞外。根據ATP結合域氨基酸序列的不同，ABC 轉運蛋白家族可分為7個亞型，即ABCA~G，包括ABCB1（也稱為多藥耐藥-1，MDR1）、ABCG2（乳腺癌耐藥蛋白，BCRP）以及ABCC2（多藥耐藥相關蛋白-2，MRP2）等，均在多藥耐藥中發揮著重要的作用［6］。既往研究也多集中在這些基因與藥物不良反應及療效的相關性上［7-8］。另一方面，除藥物代謝外，ABC轉運體還可作為癌癥患者預后的生物標志物。研究證實，在腫瘤干細胞中有多種ABC 轉運體，如ABCG2 和ABCC2，這些轉運體通過主動外排缺氧條件下產生的細胞毒性代謝物，保護腫瘤干細胞免受缺氧相關細胞損傷，延長腫瘤干細胞的存活期［9］。有文獻報道ABC轉運蛋白低表達與多種惡性腫瘤，如肝內膽管癌、前列腺癌、頭頸鱗癌等患者預后差有關［10-12］。ABCC2 作為ABC轉運家族的一員，在藥物分布、代謝和清除以及胞外運輸中發揮著重要的作用，相較于分化好的腫瘤，ABCC2 在組織學分級高、分化差的腫瘤中表達更高。

3.2 ABCC2 基因多態性與惡性腫瘤 ABCC2 基因的SNP 與腫瘤細胞的藥物抵抗、化療藥物清除和相關毒性以及患者預后有關［13］。目前，有關食管鱗癌中該基因多態性與患者復發關系的研究少見，但在胰腺癌、肺癌、乳腺癌、結直腸癌等惡性腫瘤患者中ABCC2 與療效和預后相關。在胰腺導管腺癌中，ABCC2 基 因 多 態 性 包 括rs3740067、rs3740073、rs717620、rs2273697 等的次要等位基因與患者預后差顯著相關［14］。乳腺癌中，純合子野生型ABCC2 rs717620 可致外排蛋白表達增加，引起他莫昔芬活性代謝物在胞內和血漿水平的有效濃度降低，導致治療失敗和患者術后復發［15］。肺癌中，ABCC2等位基因變異與化療藥物誘導的毒性和生存期有關［16-17］。而在結直腸癌中，ABCC2 的表達與DFS 延長有關［18］。由于人種及腫瘤類型的差異，對于ABCC2 基因多態性的影響，各研究結論不一，但均證實了其在腫瘤中起到了關鍵的調節作用。本研究中的ABCC2 rs3740066與胰腺癌研究中的rs3740067處于高度連鎖不平衡，rs3740066 為錯義變異，可能影響ABCC2 的表達與功能。與胰腺癌研究結論相似，本研究發現該SNP 的次要等位基因與預后不良相關。有研究認為ABCC2 影響預后的機制之一是通過活性氧（ROS）的信號活動。ROS是腫瘤細胞存活和轉移的關鍵調控因素，包括侵襲、黏附、血管生成和增殖［19］。手術誘發的炎癥反應創造了富含ROS的環境，而ABCC2可能通過轉運活性氧影響腫瘤細胞生存，但具體機制以及SNP 在其中發揮的作用仍需生物學實驗探索及驗證。

3.3 研究的局限性 由于筆者所在內科病區的術后輔助治療患者較少，加之部分患者拒絕簽署知情同意提供血液學樣本，故本研究樣本量較小，導致檢驗效能較低，因此可能會遺漏有統計學意義的關聯。例如，本研究未發現選擇的臨床因素，如性別、年齡等與DFS 相關，而既往對臨床因素的研究也缺乏統一的結論，因此可能由于臨床因素并不影響無病生存，但也可能是由檢驗效能低所導致。此外，作為回顧性研究，本研究可能會受到如回憶偏倚、混雜偏倚、測量偏倚等的影響，從而影響研究結果。基于定義，需要控制的混雜偏倚指的是“時間上發生在自變量和因變量之前，并能同時影響自變量和因變量的因素”，而SNP作為胚系突變，受混雜因素影響不大，因此本研究僅對性別和年齡做了校正，對圍手術期治療及分期等未行控制。而其他偏倚對作為胚系突變的SNP 及相關研究結論影響則更小。第三，出于對假陽性的顧慮，本研究采用了半貝葉斯收縮，收縮后并未發現有統計學意義的關聯。由于缺乏生物機

制研究，且流行病學證據有限，因此本研究選擇了先驗系數均值0、方差1.92的正態分布，即指數化后先驗HR95%CI為1.000（0.250~4.000），該選擇是主觀的，可能影響研究結論的客觀性。綜上，雖然經過半貝葉斯收縮，未發現有統計學意義的結果，但并不能夠得出“基因多態性與無病生存期不存在關聯”的結論；相反，受小樣本量及多次檢驗的影響，以及半貝葉斯結果的提示，強烈建議未來更多的基礎研究和大樣本研究加以驗證。最后，由于缺乏相應的生物學機制研究，因此該研究的結論難以在功能層面上進行解釋，也對未來生物機制研究提出了更高的要求。

Tab.4 The effect of SNPs on disease free survival表4 SNP對無病生存期的影響分析

綜上所述，本研究發現藥物代謝動力學基因ABCC2 rs3740066 與食管鱗癌術后患者無病生存相關。但由于缺乏生物學研究，ABCC2 rs3740066 在其中發揮作用的機制尚不清楚，因此在需要更大樣本量研究證實的同時，也需要更多的基礎實驗加以驗證。