Notch 信號通路在妊娠期DN 小鼠中的表達意義

石 琳，陳國慶，王艷榮，雷 晨，張 勇

（1.寧夏醫科大學總醫院兒科，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫科大學總醫院內分泌科，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫科大學公共衛生學院，寧夏 銀川 750004）

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是指在妊娠期發生或首次發現的不同程度的糖耐量異常，隨著肥胖的流行和孕產婦年齡的增高，GDM 患病率不斷上升[1]。GDM 可增加巨大兒、難產兒、早產兒、畸形胎兒及死胎的分娩率[2]。研究表明，GDM 時高糖狀態可刺激腎組織細胞葡萄糖轉運異常，導致孕婦腎組織糖原累積，從而增加對葡萄糖的利用，以致產生過多的中間代謝產物，最終通過激活多元醇通路、晚期糖基化終末代謝產物、二酰甘油-蛋白激酶C 途徑等進一步損害腎臟組織[3]。而GDM腎臟損害的發病機制極其復雜，血脂異常、高血壓、血管功能障礙及其他心臟代謝異常等因素均與GDM 腎臟損害有關[4]。近年來，不斷有研究發現Notch 信號通路在腎小管上皮細胞損傷中發揮著重要作用[5-6]。但Notch 信號通路在GDM 腎臟損害中的作用機制尚不清楚。本研究通過建立GDM 小鼠模型，檢測小鼠腎組織標本中Notch 信號通路家族成員（Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1）的表達情況，以觀察Notch 信號通路是否參與妊娠期糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）腎臟損害過程，旨在深入分析妊娠期DN 腎臟損害的發病機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

12 只清潔級別的C57BL/6 小鼠（6～8 周齡）由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，體重18～22g，實驗動物合格證號：[SCXK（京）：2019-0007]。飼養條件：溫度控制在22℃～26℃，相對濕度控制在50%～60%，光照條件控制為12h 光處理和12h 暗處理交替循環，適應性喂養2 周。本研究方案通過單位動物倫理學審查。

1.2 試劑與儀器

①試劑：鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，北京索萊寶科技有限公司），水合氯醛（天津市光復精細化工研究所），蛋白酶抑制劑[中科瑞泰（北京）生物科技有限公司]，聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、增強型化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），一抗Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1（Thermo Fisher 公司），β-actin 抗體（英國Abcam 公司），辣根過氧化酶標記二抗（北京全式金生物技術有限公司），PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒（日本Takara 公司），LightCycler 480 SYBR Green I Master 試劑盒（Roche 公司），葡萄糖測定試劑盒（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司），糖化血紅蛋白分析試劑盒（挪威Axis-Shield 公司）。②儀器：石蠟切片機（德國SLEE 公司），全自動生化分析儀（美國Beckman 公司），實時熒光定量PCR 儀、蛋白印跡電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與模型的建立

所有小鼠使用普通實驗動物飼料適應性喂養2周，按2:1 的比例將雌鼠與雄鼠合籠，于第2 日清晨檢查小鼠陰道栓或陰道分泌物涂片鏡檢，發現精子者記為妊娠0 天，標記孕鼠開始計算孕期，所有雌鼠孕前血糖水平正常。將孕鼠分為DN 組和對照組，每組各6 只。DN 組孕鼠腹腔注射2% 的STZ 溶液（55mg/kg），以制備DN 模型，對照組孕鼠予以腹腔注射等量枸椽酸鹽緩沖液（0.1mmol/L）。1 周后測定造模小鼠的血糖和尿糖水平，血糖≥16.67mmol/L、尿糖≥3+為造模成功的DN 小鼠，分別于成模后2、4、8 周，收集小鼠血液，檢測生化指標；8 周末，使用10%水合氯醛腹腔注射處死小鼠，取其腎臟組織，使用4%中性甲醛固定用于HE 染色及免疫組織化學染色；取部分腎臟組織用于提取蛋白和RNA，Western blot 檢測Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1 蛋白表達，Real-time PCR 檢測Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 的表達。

1.3.2 生化指標檢測

生化指標包括血糖（blood glucose，Glu）、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）及尿酸（uric acid，UA）水平。采用己糖激酶法檢測Glu 水平，采用HbA1c 分析試劑盒檢測HbA1c 水平，采用全自動生化分析儀檢測Scr、BUN、UA 水平。

1.3.3 HE 染色

取兩組小鼠腎組織標本，制作石蠟切片，進行蘇木精伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，于光鏡下觀察腎臟組織的病理學形態，并拍照。

1.3.4 免疫組織化學染色

取兩組腎臟組織標本，制作石蠟切片，常規脫蠟水化，進行抗原修復，加入3%H2O2清除內源性過氧化物酶，滴加山羊血清進行封閉，滴加一抗[Notch1（1∶300）]，滴加二抗，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，進行DAB 顯色，滴加蘇木精復染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照。陽性結果：可見棕黃色或棕褐色染色。

1.3.5 Western blot檢測Notch信號通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表達水平

取兩組腎臟組織標本，加入1mL 蛋白裂解液進行組織勻漿，冰上裂解30min，4℃、12 000rpm 離心10min，棄掉上清液，測定蛋白濃度；取30μg 蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜、封閉，一抗[Notch1（1∶500）、Jagged1（1∶300）、Hes1（1∶300）、Hey1（1∶500）、β-actin（1∶5 000）]孵育過夜，二抗（1∶5 000）孵育2h；滴加預先配制的ECL 化學發光混合液，避光靜置5min，置于顯影儀中曝光顯影并拍照，采用Gel 凝膠圖象處理軟件檢測各樣品蛋白灰度值，并計算目的蛋白表達水平，目的蛋白表達水平以目的蛋白灰度值和內參蛋白灰度值比值表示。

1.3.6 Real-time PCR 檢測Notch 信號通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相對表達量

取兩組腎臟組織標本，加入1mL Trizol 溶液進行裂解，按說明書操作提取總RNA；測定RNA 濃度，使用PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒進行逆轉錄，得到cDNA；以cDNA 為模板進行RT-PCR，Jagged1、Notch1、Hes1 和Hey1 作為目的基因，β-actin作為內參基因。β-actin 引物序列為：F：5′-CGT GCG TGA CAT CAA AGA GAA-3′，R：5′-CCA AGA AGA AGG CTG GAA AA-3′；Notch1 引物序列為：F：5′-GTG GAT GAC CTA GGC AAG TCG-3′，R：5′-GTC TCC TCC TTG TTG TTC TGC A-3′；Jagged1 引物序列為：F：5′-AGA AGT CAG AGT TCA GAG GCG TCC-3′，R：5′-AGT AGA AGG CTG TCA CCA AGC CAA C-3′；Hes1引物序列為：F：5′-CAC GAC ACC GGA CAA ACC A-3′，R：5′-GCC GGG AGC TAT CTT TCT TAA GTG-3′；Hey1 引物序列為：F：5′-AAG ACG GAG AGG CAT CAT CGA G-3′，R：5′-CAG ATC CCT GCT TCT CAA AGG CAC-3′。引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，采用2-△△Ct法計算Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相對表達水平。

1.4 統計學方法

運用SPSS 20.0 統計學軟件分析數據，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，兩組間對比采用t檢驗，組內不同時間對比采用重復測量方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠腎臟組織形態觀察結果

8 周時，HE 染色可見對照組小鼠腎小管結構清晰且正常，而DN 組小鼠腎小球體積增大，基底膜不規則增厚，腎小管上皮細胞出現空泡樣變性，見圖1。

圖1 HE 染色觀察小鼠腎組織形態（×400）Fig.1 Observation of kidney tissue morphology of mice by HE staining(×400)

2.2 兩組小鼠生化指標比較

2 周、4 周、8 周時，DN 組小鼠Glu、HbA1c、Scr、BUN 及UA 水平均顯著高于對照組小鼠（P＜0.05），且HbA1c、Scr、BUN 及UA 水平隨著DN 病程延長而升高，見表1。

表1 兩組小鼠生化指標比較（±s）Table 1 Comparison of biochemical indicators between the two groups (±s)

表1 兩組小鼠生化指標比較（±s）Table 1 Comparison of biochemical indicators between the two groups (±s)

注：F1、P1 是DN 組2 周、4 周、8 周的比較；t1、P1 為對照組與DN 組2 周比較；t2、P2 為對照組與DN 組4 周比較；t3、P3 為對照組與DN 組8 周比較。

組別對照組DN 組2 周4 周8 周F1/P1 t1/P1 t2/P2 t3/P3 Glu（mmol/L）7.75±1.30 HbA1c（%）3.49±0.68 Scr（μmol/L）24.16±4.05 BUN（mmol/L）10.31±2.57 UA（μmol/L）102.05±16.39 128.27±19.03 145.49±21.15 185.72±24.68 11.030/0.001 2.557/0.029 3.977/0.003 6.981/＜0.001 26.83±3.74 27.50±3.09 29.84±4.16 1.101/0.358 11.804/＜0.001 14.431/＜0.001 12.415/＜0.001 6.72±0.81 10.06±1.47 15.37±2.03 49.370/＜0.001 7.481/＜0.001 9.936/＜0.001 13.593/＜0.001 30.35±4.98 37.81±6.33 51.83±7.92 16.778/＜0.001 2.362/0.040 4.449/0.001 7.619/＜0.001 19.10±2.84 24.94±4.16 36.18±6.04 21.931/＜0.001 5.621/＜0.001 7.329/＜0.001 9.654/＜0.001

2.3 免疫組織化學染色觀察兩組小鼠腎臟組織中Notch1 表達情況

免疫組織化學染色結果顯示，Notch1 陽性定位于腎小球固有細胞及腎小管上皮細胞胞漿，呈黃色或棕黃色，對照組小鼠腎小球和腎小管上皮細胞中幾乎不表達Notch1，DN 組小鼠腎小球中可見少量Notch1表達，腎小管上皮細胞Notch1大量表達，見圖2。

圖2 免疫組織化學染色觀察兩組小鼠腎組織中Notch1 表達情況（×400）Fig.2 Observation of Notch1 expression in kidney tissue of mice in the two groups by immunohistochemical staining(×400)

2.4 兩組小鼠Notch 信號通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表達水平比較

DN 組小鼠Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表達水平均顯著高于對照組小鼠（P＜0.05），見表2。

表2 兩組小鼠Notch 信號通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of protein expression levels of Notch1, Jagged1, Hes1 and Hey1 in Notch signaling pathway between the two groups of mice(±s)

表2 兩組小鼠Notch 信號通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of protein expression levels of Notch1, Jagged1, Hes1 and Hey1 in Notch signaling pathway between the two groups of mice(±s)

組別對照組DN 組tP Notch1 0.14±0.03 0.23±0.05 3.781 0.004 Jagged1 0.42±0.06 0.85±0.09 9.738＜0.001 Hes1 0.38±0.05 0.77±0.06 12.231＜0.001 Hey1 0.17±0.04 0.39±0.07 6.684＜0.001

2.5 兩組小鼠Notch 信號通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1mRNA 相對表達量比較

DN 組小鼠Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相對表達量均顯著高于對照組小鼠（P＜0.05），見表3。

表3 兩組小鼠Notch 信號通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相對表達量比較（±s）Table 3 Comparison of mRNA relative expression levels of Notch1, Jagged1, Hes1 and Hey1 in Notch signaling pathway between the two groups of mice(±s)

表3 兩組小鼠Notch 信號通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相對表達量比較（±s）Table 3 Comparison of mRNA relative expression levels of Notch1, Jagged1, Hes1 and Hey1 in Notch signaling pathway between the two groups of mice(±s)

組別對照組DN 組tP Notch1 1.02±0.07 1.55±0.19 6.411＜0.001 Jagged1 0.98±0.08 1.64±0.15 9.510＜0.001 Hes1 0.95±0.07 2.41±0.22 15.490＜0.001 Hey1 1.03±0.05 1.68±0.16 9.498＜0.001

3 討論

3.1 Notch 信號通路在腎小球疾病中的作用

在許多慢性腎臟疾病中，Notch 信號通路成員被認為是腎損害的生物標志物[7]。Notch 信號通路可在腎再生、足細胞凋亡、增殖、成纖維細胞活化及誘導腎小管上皮細胞向間充質轉化等過程中發揮重要作用[8]。Yao 等[9]通過使用血管緊張素Ⅱ刺激小鼠足細胞，結果發現，小鼠足細胞中Notch1、Hes1、Ⅳ型膠原和層粘連蛋白表達明顯上調，而干擾Notch 可抑制Ⅳ型膠原和層粘連蛋白表達，提示Notch 信號通路在血管緊張素Ⅱ誘導的足細胞外基質合成中起著重要作用。Nishad 等[10]報道指出，激活Notch 信號通路可調控上皮間充質轉換和腎纖維化，抑制Notch 信號通路可能成為DN 的潛在治療靶點。故Notch 信號通路可能是糖尿病腎臟損害的原因之一。

3.2 Notch 信號通路與DN 腎臟損害的關系

方曉琳等[11]研究表明，通過抑制Notch 信號通路可降低高糖誘導的人腎小管上皮HK-2 細胞內活性氧的產生，從而抑制腎小管上皮細胞凋亡。另外，有研究亦顯示，調節活性氧產生和誘導細胞凋亡的重要蛋白適配器P66shc 在STZ 誘導的DN 小鼠中表達明顯上調，培養的MPC5 足細胞經高糖處理后其存活率明顯降低，P66shc 過表達進一步加速細胞凋亡，而抑制Notch 信號通路可下調P66shc 表達，提示高糖環境下P66shc 通過Notch 信號通路誘導足細胞凋亡[12]。本研究結果顯示，2 周、4 周、8 周時，DN 組小鼠Glu、HbA1c、Scr、BUN 及UA 水平均顯著高于對照組小鼠，且HbA1c、Scr、BUN 及UA 水平隨著DN病程延長而升高，表明DN 小鼠存在明顯的腎損傷，且隨著病程延長，小鼠腎損傷越嚴重。本研究中，免疫組織化學染色結果顯示，對照組小鼠腎小球和腎小管上皮細胞中幾乎不表達Notch1，DN 組小鼠腎小管上皮細胞Notch1 大量表達，腎小球中也可見少量Notch1 表達，提示Notch1 上調表達參與了DN 小鼠腎損傷過程。

本研究通過進一步分析發現，DN 組小鼠Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表達水平均顯著高于對照組小鼠，Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相對表達量也顯著高于對照組小鼠，提示Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 均參與了DN 小鼠腎損害過程。劉興梅等[13]報道表明，DN 小鼠腎臟組織中Notch1 蛋白表達明顯增加，自噬和纖維化被明顯抑制，其機制可能與激活蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素蛋白信號通路有關。此外，Chen 等[14]研究指出，通過阻斷Notch 信號通路能夠抑制腎小球硬化和腎小管間質損傷，從而減輕尿毒癥癥狀。Tian 等[15]亦發現，抑制Notch 信號通路可改善DN 小鼠抗氧化反應，延緩腎間質纖維化，改善糖尿病癥狀。故通過阻斷Notch 信號通路可能會減輕DN 的腎損害程度，改善DN 腎臟預后，進而為DN 臨床治療提供科學根據。但Notch 信號通路在DN 小鼠腎損害中的具體作用機制有待深入研究。

綜上所述，DN 小鼠腎臟組織中Notch 信號通路蛋白表達明顯增加，Notch 信號通路可能在DN 腎臟損害發生和發展中發揮著重要作用，深入研究Notch信號通路在DN 腎臟損害中的具體作用機制，有助于指導臨床尋找有關DN 治療的新的分子靶點，具有一定意義。