孕晚期陰道定植B 族鏈球菌的血清型和基因分型與新生兒感染的關系

羅 勇，彭新平，龍運峰，黃 佳，劉 瑾

（邵陽學院附屬第一醫院新生兒重癥監護科，湖南 邵陽 422000）

B 族鏈球菌(group B streptococcus，GBS)是一種主要定植于腸道、陰道的革蘭陽性球菌，妊娠女性定植率為10%～35%，比非妊娠女性高出20 倍[1]。孕晚期女性感染GBS 可引發流產、產褥感染、子宮內膜炎、胎膜早破、早產等不良妊娠結局；且GBS 可通過羊水、胎盤或分娩時由產道傳給新生兒，可使新生兒發生早發型GBS 感染性疾病（early-onset GBS disease，GBS-EOD），如腦膜炎、敗血癥、肺炎等嚴重疾病[2]。研究發現，孕婦感染GBS 血清型和基因分型存在種族及地區差異，且不同血清型、基因分型對新生兒GBS-EOD 的致病力有差異，對新生兒的危害程度也不同[3]。目前，孕晚期女性陰道定植GBS 血清型和基因分型與新生兒感染的關系報道較少，基于此，本研究通過確定孕晚期女性GBS 血清型、基因分型，分析兩者與新生兒GBS-EOD 發生的相關性，以期為臨床防治GBS 感染提供依據。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選取2016 年1 月至2020 年9 月于邵陽學院附屬第一醫院孕檢、分娩的1 945 例妊娠女性作為研究對象，年齡23～39 歲，平均年齡（31.64±6.70）歲；孕周35～37 周，平均孕周為（36.05±0.82）周。納入標準：①孕周為35～37 周；②單胎妊娠；③2 周內未使用抗生素；④臨床資料齊全。排除標準：①產前已明確診斷孕有畸形胎兒需引產的女性；②合并高血壓、慢性腎炎、糖尿病、急性感染、生殖器畸形等妊娠女性；③習慣性流產者。

1 945 例妊娠女性分娩的活產新生兒中有25 例發生GBS 垂直傳播，罹患新生兒GBS-EOD，其中男13 例，女12 例；胎齡37～41 周，平均胎齡為（38.42±1.23）周；日齡1～14.3h，平均日齡為（7.93±4.77）h；出生體重2 026.5～4 158.4g，平均出生體重為（3 138.53±778.92）g。新生兒GBS-EOD 診斷標準：參考邵肖梅等主編的《實用新生兒學》中新生兒GBS-EOD（腦膜炎、敗血癥、肺炎）有關判定標準[4]。納入標準：①符合GBS-EOD 診斷標準，無菌體液（血液、氣管內痰液、腦脊液）培養GBS，呈陽性；②具備完整的臨床資料。排除標準：①未見臨床感染癥狀，僅體表分泌物或氣管內痰液GBS 培養呈陽性的新生兒；②合并遺傳代謝疾病的新生兒。

孕婦或親屬均已簽署知情同意書，研究符合《赫爾辛基宣言》，經本院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本收集

所有妊娠女性于35～37 孕周產前檢查時，采集孕婦陰道下段1/3 位置的分泌物及肛門內5cm 處的直腸分泌物，送檢。在給予GBS-EOD 患兒使用抗生素治療前，收集25 例GBS-EOD 新生兒的血液、氣管內痰液、腦脊液標本，送檢。

1.2.2 孕婦陰道GBS 培養、鑒定

將收集的直腸及陰道分泌物拭子放入GBS TranSwab 裝置塑膠管內，于5%CO2、35℃培養箱中培養24h。根據試管內顏色判斷是否存在GBS，若呈胡蘿卜色則判斷為GBS 陽性；若無顏色變化，則判斷為GBS 陰性。將試管內標本轉種于胡蘿卜素β/γ 乙型鏈球菌二分格營養瓊脂培養基上培養，挑選可疑菌落，鑒定，確定GBS 生長，于-80℃冰箱中保留菌株，備檢。

1.2.3 新生兒GBS 培養、鑒定

培養新生兒血液、氣管內痰液、腦脊液標本，使用PHOENIX100 細菌鑒定系統鑒定菌株。鑒定后分離出GBS 菌株，保留于-80℃冰箱中，備檢。

1.2.4 GBS 菌株復蘇

將GBS 菌株復蘇，接種于M-H 血平板上，之后，置于5%CO2、35℃培養箱中培養，過夜。

1.2.5 GBS 血清型鑒定

利用血清分型試劑盒按乳膠凝集法確定GBS 菌株的血清型，若GBS 菌株不與Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅹ等10種乳膠凝集分型試劑發生凝集，則將其血清型定義為不可分（non-typeable，NT）型，具體操作及判斷方法參考文獻[5]。

1.2.6 GBS 基因分型鑒定

利用PCR 擴增技術對GBS 陽性樣本進行擴增，反應結束后，將PCR 擴增產物送到上海生工有限公司，進行多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）鑒定，比對測序結果。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件分析處理數據，對血清型分布、基因分型等計數資料均以例數和百分數[n（%）]描述，行Fisher 確切概率法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 孕婦陰道GBS 定植情況

對1 945 例孕晚期女性進行GBS 篩查，共檢出GBS 陽性孕婦234 例，GBS 定植率為12.03%。

2.2 孕婦陰道定植GBS 的血清型分布

234 例孕晚期女性陰道定植GBS 共檢出7 個血清型，主要血清型是Ⅲ型（52.14%）和Ⅰb 型（21.37%），其次是Ⅴ型（10.26%）和Ⅰa 型（9.83%），最后是Ⅱ型（4.70%）、NT 型（1.28%）及Ⅵ型（0.43%），見表1。

表1 孕婦陰道定植GBS 的血清型分布[n（%）]Table 1 Distribution of vaginal colonized GBS serotypes in pregnant women[n(%)]

2.3 GBS 血清型與新生兒GBS-EOD 的關系

25 例新生兒GBS-EOD 共發現5 種GBS 血清型，不同血清型引起的新生兒GBS-EOD 發生率差異無統計學意義（P＞0.05）。發病率由高到低排列依次為Ⅲ型56.00%（14/25）、Ⅰa 型24.00%（6/25）、Ⅰb 型8.00%（2/25）、Ⅱ型8.00%（2/25）、Ⅴ型4.00%（1/25）。NT、Ⅵ型GBS 未引起GBS-EOD；且Ⅲ型GBS 引起的新生兒腦膜炎、敗血癥、肺炎占比最高，分別為100.00%（3/3）、45.45%（5/11）、54.55%（6/11），見表2。

表2 孕婦陰道定植GBS 血清型與新生兒GBS-EOD 發生的關系[n（%）]Table 2 The relationship between vaginal colonized GBS serotypes in pregnant women and the occurrence of GBS-EOD in newborns[n(%)]

2.4 分娩GBS-EOD 患兒的孕婦陰道定植GBS的MLST 分型結果

對25 例GBS-EOD 患兒對應的孕晚期女性陰道定植GBS 進行MLST 分型，結果顯示，共鑒定出8 種基因型，排名前3 位的分別是ST19 型（36.00%）、ST17 型（28.00%）、ST12 型（16.00%），見表3。

表3 分娩GBS-EOD 患兒的孕婦陰道定植GBS 的MLST 分型結果[n（%）]Table 3 MLST classification results of vaginal colonized GBS in pregnant women delivered infants with GBS-EOD[n(%)]

2.5 分娩GBS-EOD 患兒的孕婦陰道定植GBS的MLST 分型與新生兒GBS-EOD 的關系

不同GBS 的MLST 分型引起的新生兒GBSEOD 發病率差異無統計學意義（P＞0.05）。ST19型GBS 在新生兒腦膜炎、肺炎中占比最高，分別為66.67%（2/3）、54.55%（6/11）；ST17、ST12 型在新生兒敗血癥中占比較高，分別為36.36%（4/11）、27.27%（3/11），見表4。

表4 分娩GBS-EOD 患兒的孕婦陰道定植GBS 的MLST 分型與新生兒GBS-EOD 發生的關系[n（%）]Table 4 Relationship between MLST classification of vaginal colonized GBS in pregnant women delivered infants with GBSEOD and the occurrence of neonatal GBS-EOD [n(%)]

3 討論

3.1 孕婦陰道GBS 定植率

GBS 是一種β 溶血的厭氧菌，是導致圍產期母嬰感染的條件致病菌，可造成新生兒GBS-EOD，具有病死率、患病率高的特點，嚴重危及母嬰健康[6]。此外，GBS 血清型及基因分型與新生兒GBS-EOD 有關[3]。因此，及時確定本地區GBS 血清型及基因分型，對及時防治GBS 感染、改善母嬰結局有積極意義。本研究顯示，1 945 例孕晚期女性GBS 定植率為12.03%，略高于楊夢楠等[7]檢測孕晚期女性GBS 的定植率（11.7%），可能與地區不同相關，提示GBS 在本地區孕晚期女性中有一定定植，應對該地區妊娠女性進行GBS 篩查。

3.2 孕婦陰道定植GBS 的血清型分布

GBS 的抗原結構包含特異性碳水化合物抗原、核蛋白抗原、特異性莢膜多糖抗原，按特異性莢膜多糖抗原不同可將GBS 分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅹ等10 種血清型，但有些GBS 無特異性莢膜多糖抗原，無法檢測其血清型，為NT 型[8]。不同血清型的GBS 致病能力不同，Ⅲ、Ⅰa 型毒力較強，Ⅲ型感染發病率最高，在孕婦定植和新生兒感染中最為常見（約為50%）[3]。林雅茵等[9]報道顯示，廈門市GBS 感染孕婦中檢測出8 種血清型，占比較高的前5 位為Ⅲ型（54.2%）、Ⅰb 型（17.7%）、Ⅰa 型（10.0%）、Ⅴ型（9.7%）、Ⅱ型（8.0%），而高爽等[10]研究發現沈陽地區孕晚期女性定植GBS 多以Ⅰa 型（44.22%）、Ⅴ型（38.65%）、Ⅲ型（13.94%）為主要血清型。以上研究表明，不同地區孕晚期女性陰道GBS 血清型有所差異。本研究中孕晚期女性陰道定植GBS 檢出7 個血清型，以Ⅲ型（52.14%）、Ⅰb 型（21.37%）、Ⅴ型（10.26%）、Ⅰa型（9.83%）為主，Ⅲ型GBS 占比最高，與林雅茵等[9]研究結果不完全一致，這可能與地區、個體差異、檢測時間不同等相關。

3.3 孕婦陰道定植GBS 血清型與新生兒GBSEOD 發生的關系

本研究顯示，在25 例GBS-EOD 新生兒中發現5種血清型GBS，Ⅲ型發病率最高（56.00%），其次為Ⅰa 型（24.00%），之后為Ⅰb 型、Ⅱ型、Ⅴ型，與Zhu等[11]研究相似，且NT、Ⅵ型GBS 未見致病，提示Ⅲ、Ⅰa 型GBS 毒力最強，Ⅰb 型、Ⅱ型、Ⅴ型、NT、Ⅵ等血清型的GBS 致病力較弱，確定GBS 血清型可為臨床防治新生兒GBS 感染提供有效的指導。另外，本研究中25 例新生兒GBS-EOD 中，新生兒腦膜炎3例（12.00%）、新生兒敗血癥11 例（44.00%）、肺炎11 例（44.00%），提示新生兒GBS-EOD 多表現為敗血癥和肺炎。進一步分析發現，GBS-EOD 腦膜炎、敗血癥、肺炎的GBS 血清型均是以Ⅲ型為主，其中GBS-EOD 腦膜炎的GBS 血清型均是Ⅲ型，提示Ⅲ型GBS 是導致新生兒腦膜炎的最主要血清型。

3.4 分娩GBS-EOD 患兒的孕婦陰道定植GBS的MLST 分型及其與新生兒GBS-EOD 的關系

本研究顯示，25 例GBS-EOD 新生兒中鑒定出8種ST 分型的GBS，ST19 型發病率最高，其次為ST17 型，之后為ST12、ST23、ST171、ST456、ST485、ST651 型，且ST19、ST17、ST12 型新生兒GBS-EOD 發生率分別為 36.00%、28.00%、16.00%，提示ST19、ST17、ST12 型GBS 致病力較強，檢測GBS 基因分型有利于臨床上防治新生兒GBS 感染。而Zhu 等[12]發現ST17 型GBS 在新生兒GBS-EOD 中最為常見，與本研究不一致，可能是選取人群差異造成的，故可通過確定GBS 基因分布特點指導當地臨床防治GBS 感染的工作。進一步研究發現，新生兒GBS-EOD 腦膜炎、肺炎均以ST19 型GBS 感染為主，敗血癥以ST17、ST12 型GBS 感染為主，提示GBS 基因分型可能與GBS 感染的臨床表現差異相關，確定當地GBS 基因型分布情況有助于臨床防治新生兒GBS-EOD 類疾病，為生產有效疫苗提供參考。

綜上所述，孕晚期陰道定植GBS 血清型、基因分型與新生兒GBS-EOD 顯著相關，其中以Ⅲ型血清型、ST19 基因型最為常見，且GBS 血清型、基因分型與GBS 感染的不同臨床表現密切相關，研究GBS 血清型、基因型分布有利于了解不同血清型、基因型的致病力及流行病學特征，進而探究免疫原性，為針對性制備GBS 疫苗提供依據。但本研究樣本數據較小，不能反映國內整體情況，后續仍需擴大樣本，為研制有針對性的GBS 疫苗提供依據。