CD14-TLR4-NF-κB信號傳導通路在脂多糖誘導ALI/ARDS中的作用及機制研究

金肇權，張文彬，陳欣，朱濱

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由多種致病因素所導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞受損，可造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，最終引起急性低氧性呼吸功能不全［1-2］。隨著病情進一步惡化，ALI 常演變為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）［3］，臨床癥狀主要表現為頑固性低氧血癥，具有較高的致死率［4］。ALI/ARDS 既是多種呼吸道重癥的發病基礎，又是全身炎癥活動劇烈時較易出現的綜合征［5］。近年來，ALI/ARDS 的發生發展機制及其影響因素已成為臨床研究熱點問題。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是由脂質和多糖所構成的復合物，有研究表明，脂多糖常通過Toll 樣受體（toll-like receptors，TLR）家族參與機體炎性活動和免疫反應，與機體多種炎性疾病的發生發展密切相關［6］。另據研究顯示，白細胞分化抗原14（leukocyte differentiation antigen 14，CD14）作為脂多糖受體，其主要生物學活性是識別、結合脂多糖復合物，參與、把控脂多糖性細胞反應［7］；TLR4 作為TLR 家族的主要成員之一，是參與非特異性免疫應答反應和炎癥反應的主要蛋白質因子［8］；而核因子激活的B 細胞的κ-輕鏈增強（enhancement of kappa light chain in nuclear factor activated B cells，NF-κB）通過結合多種炎性細胞因子或腫瘤壞死因子，參與機體各種炎癥活動，并與多種炎癥疾病的發生發展密切相關［9］。但目前臨床鮮有研究探討過CD14、TLR4、NF-κB 以及脂多糖等細胞因子在ALI/ARDS 發病中的作用，本次研究以此目標為出發點，對大鼠進行ALI/ARDS 造模實驗，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料清潔級健康雄性SD 大鼠90 只，8～10周，體質量（187.52±5.16）g，購買于北京寶元興業科技有限公司［SYXK（京）2020-0167］。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 動物分組與實驗方法將90只SD大鼠隨機分為A、B、C 三組，每組各30 只。A 組和B 組大鼠在左側尾靜脈部位注射內毒素9 mg/kg，制造大鼠ALI/ARDS 模型。C 組大鼠靜脈注射生理鹽水。給予A組大鼠CD14 模擬物、TLR4 模擬物以及NF-κB 模擬物靜脈注射。取大鼠肺組織，留取一半肺組織，4%甲醛溶液固定，用于病理染色；剩余組織置于液氮中速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于蛋白質印跡法檢測。

1.3 儀器與試劑大鼠sEPCR 檢測試劑盒（上海信裕生物工程有限公司）；Trizol試劑（武漢科昊佳生物科技有限公司）；Lipofectamine 2000 轉染試劑［上海賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；血液分析儀（日本SYSMEX）及配套試劑檢測血常規指標；全自動生化分析儀（北京普朗新技術有限公司）；大鼠肺功能儀（北京廣源達科技發展有限公司）；血氣電解質分析儀（南京普朗醫療設備有限公司）。

1.4 CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖樣本收集和檢測方法CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖蛋白表達：采用蛋白質印跡法。取部分梗阻側腎組織標本，勻漿器充分研磨后加入裂解液裂解并提取總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度。根據目標蛋白大小配置適合濃度的凝膠、分離膠和濃縮膠。電泳加壓轉膜后脫脂奶粉封閉1 h。加入特異性CD14 抗體、TLR4 抗體、NF-κB P65 抗體和脂多糖抗體，稀釋比例為1∶1 000，以β-actin（1∶5 000）作為對照。去除一抗，洗滌后加入二抗，室溫孵育2 h，漂洗，化學發光法X 線片顯影，采用Image J 軟件得到條帶灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.5 HE 染色（1）甲醛固定的肺組織采用石蠟包埋的方法制備成厚度5～7 μm 的石蠟病理切片，檢測時先行脫蠟水化，水化后的肺組織切片放入蘇木精水溶液中染色3 min。（2）流水沖洗掉多余的蘇木精，1%的鹽酸乙醇分化5～8 s，0.6%氨水返藍5～8 s。（3）流水沖洗1 h 后入蒸餾水片刻。（4）70%和90%乙醇中脫水各10 min。（5）乙醇伊紅染色液染色2～3 min。（6）染色后的切片經純乙醇脫水，經二甲苯使切片透明。（7）將已透明的切片滴上加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固。

1.6 觀察指標（1）三組大鼠造模后呼吸頻率（respiratory rate，RR）、動脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）：采用大鼠肺功能儀對大鼠RR 進行檢測，于造模后采集大鼠動脈血5 mL，并采用血氣電解質分析儀對其PaO2進行分析；（2）三組大鼠的CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖蛋白表達水平；（3）三組大鼠的CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖蛋白相關性；（4）HE 染色結果；（5）肺組織損傷Murray 評分［10］：主要根據低氧血癥評分、呼氣末正壓及肺順應性等指標，各項評分均為0～4 分。肺組織損傷評分為四項結果評分相累加。

1.7 統計學方法采用SPSS 22.0 系統軟件分析，其中符合正態分布的計量資料以表示，三組間比較采用方差檢驗，差異有統計學意義者進一步采用事后LSD-t檢驗分析兩兩間差異；Pearson 相關系數分析CD14 蛋白、TLR4 蛋白、NF-κB P65 蛋白和脂多糖蛋白的相關性，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠造模后RR、PaO2分析造模12 h 后，在三組大鼠的RR方面：A組＞B組＞C組，組間均差異有統計學意義（均P＜0.001）；而在PaO2方面：A 組＜B 組＜C 組，各組間均差異有統計學意義（均P＜0.001），見表1。

表1 90只大鼠造模12 h后的RR與PaO2比較/

表1 90只大鼠造模12 h后的RR與PaO2比較/

注：RR為呼吸頻率，PaO2為血氧分壓。①與A組比較，P＜0.001。②與B組比較，P＜0.001。

2.2 三組大鼠的CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖蛋白表達對比CD14 蛋白、TLR4 蛋白、NF-κB P65 蛋白和脂多糖蛋白表達方面：A 組＞B 組＞C 組，任意兩組間的均差異有統計學意義（均P＜0.001），見表2。

表2 90只大鼠的CD14、TLR4、NF-κB P65和脂多糖蛋白表達對比/

表2 90只大鼠的CD14、TLR4、NF-κB P65和脂多糖蛋白表達對比/

注：CD14 為白細胞分化抗原14，TLR4 為趨化因子受體4，NFκB P65為核因子-κB P65。①與A組比較，P＜0.001。②與B組比較，P＜0.001。

2.3 A 組大鼠實驗后的CD14、TLR4、NF-κB P65和脂多糖蛋白相關性研究Pearson 相關性分析顯示，A 組大鼠的脂多糖蛋白分別與CD14 蛋白、TLR4蛋白以及NF-κB P65 蛋白均呈正相關（P＜0.05），見表3、圖1。

圖1 急性肺損傷大鼠各蛋白與脂多糖蛋白（LPS）相關性：A為白細胞分化抗原14（CD14）蛋白；B為趨化因子受體4（TLR4）蛋白；C為核因子-κB（NF-κB P65）蛋白

表3 急性肺損傷大鼠實驗后的白細胞分化抗原14（CD14）、趨化因子受體4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB P65）和脂多糖蛋白相關性研究

2.4 HE 染色圖光鏡下可見C 組大鼠肺組織切片肺泡結構較為清楚，未發生炎性細胞滲出、浸潤。B組大鼠可見較為明顯的肺灶性出血，肺泡和肺間質水腫，并且存在較多的炎性細胞浸潤。A 組大鼠可見肺灶性出血、肺泡和肺間質水腫以及炎性細胞浸潤情況較B組更為嚴重。

2.5 肺組織損傷評分肺組織損傷評分方面：A 組為（14.73±0.52）分，B 組為（9.54±0.37）分，C 組為（5.38±0.07）分，且A＞B＞C，三組比較差異有統計學意義（F=479.13，P=0.001），B 組與A 組、C 組比較，均P＜0.001。

3 討論

ALI/ARDS 是臨床上較為常見的肺部危重癥之一，具有一定的致死率［11］。近年來，隨著我國人口老齡化進程的加速，社會工業化的不斷發展以及空氣污染的日益嚴峻，ALI/ARDS 發病率呈不斷上升趨勢［12］。ALI/ARDS 作為一種臨床綜合征，好發于創傷、休克和感染等病人中，其主要臨床癥狀表現為呼吸窘迫以及頑固性低氧血癥［13］。目前，臨床治療方案主要包括藥物療法配合氧療、機械通氣等對ALI/ARDS 病人進行治療，但部分病人因病情較重或治療方式不當，治療效果較差［14］。但目前臨床關于影響ALI/ARDS 發生發展因素及其作用機制尚未明確，而相關研究表明炎癥反應可能是影響ALI/ARDS 發病的重要因素之一［3］。本研究對大鼠進行ALI/ARDS 模型培養，并給予部分ALI/ARDS 模型大鼠CD14 模擬物、TLR4 模擬物以及NF-κB 模擬物靜脈注射，旨在觀察CD14-TLR4-NF-κB 信號傳導通路在脂多糖誘導ALI/ARDS中作用及機制。

本研究結果顯示，ALI/ARDS 模型組大鼠造模后的RR 明顯高于正常組大鼠，而PaO2則明顯低于正常組大鼠，尤其是經模擬物轉染組大鼠，其變化幅度進一步擴大，這與武昊天等［15］研究結果相一致。RR 是指單位時間內的呼吸次數，其呼吸頻率明顯加快表明機體出現呼吸窘迫現象，是ALI/ARDS 等肺部疾病的主要癥狀之一［16］。PaO2即動脈血中氧分子物理溶解時出現的張力，主要反映了機體是否缺氧以及缺氧的程度。PaO2明顯降低在一定程度上反映了機體存在缺氧狀況，同樣是ALI/ARDS等肺部疾病的常見臨床癥狀［17］。因此，研究結果表明了大鼠ALI/ARDS 造模成功，而經CD14 模擬物、TLR4 模擬物以及NF-κB 模擬物轉染后，大鼠病變程度進一步加重，反映了這3 項因子對大鼠機體炎性活動和ALI/ARDS病情惡化的促進作用。CD14作為脂多糖的受體，由糖蛋白構成，能夠識別、結合脂多糖，還可作為革蘭陰性或陽性細菌等其他產物的受體，在炎癥反應、內毒素休克等病理反應中均具有重要作用。TLR4作為TLR4家族的主要成員之一，對獲得性免疫應答反應具有調控作用，其活化后將激活機體抗微生物防御系統，產生IL-6 和TNF以及趨化型細胞因子，并最終參與機體炎癥反應。NF-κB P65 作為NF-κB 家族重要一員，參與細胞對外界刺激的響應，如細胞因子、輻射、重金屬、病毒等，在炎癥反應、免疫應答等過程中均起到關鍵作用。Ness T 等［18］在研究中發現，CD14-TLR4-NF-κB信號傳導通路與機體炎癥反應和免疫應答等密切相關，本研究結果表明增強CD14-TLR4-NF-κB 信號傳導通路能夠加劇ALI/ARDS 模型大鼠的病情惡化程度。

本研究對造模后三組大鼠的CD14、TLR4、NFκB P65 和脂多糖蛋白表達做出比較，結果顯示，大鼠ALI/ARDS 造模后，其CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖的蛋白表達均明顯上升，尤其是給予模擬物注射組模型大鼠，其變化幅度更大，這與Wu 等［19］學者的研究結果相一致。本研究還對模擬物注射組模型大鼠的脂多糖蛋白與CD14 蛋白、TLR4 蛋白、NF-κB P65 蛋白的相關性作出探討，結果顯示均呈正相關。脂多糖主要由多糖和脂質構成，脂多糖主要通過誘導存在于目標細胞的細胞膜中的TLR4 來表現其作用［20］。TLR4 與內毒素結合蛋白共同作用捕獲脂多糖，并將其然后將其輸送給CD14 和NFκB P65 分子，最終作用于機體炎癥活動與免疫反應［21］。研究結果說明，增強CD14-TLR4-NF-κB 信號傳導通路能夠通過誘導脂多糖類因子的表達上升，并最終加快機體ALI/ARDS 病情發展與惡化。本研究還對三組大鼠造模后的肺組織切片進行染色，結果顯示經模擬物轉染后，其肺灶性出血、肺泡和肺間質水腫以及炎性細胞浸潤情況較普通ALI/ARDS模型組大鼠更為嚴重，而其肺組織損傷程度也更為嚴重。上述研究結果說明經模擬物轉染后，大鼠的ALI/ARDS相關炎性活動更加顯著。

綜上所述，CD14-TLR4-NF-κB 信號傳導通路能夠增強脂多糖表達并促進機體的炎性活動，參與ALI/ARDS 的發生、發展。本研究尚存在一些不足之處，本研究僅對CD14-TLR4-NF-κB 信號傳導通路在大鼠ALI/ARDS 中作用及機制進行了探討，未來的研究中可以取手術治療的ALI/ARDS 病人的病變肺組織切片進行轉染，觀察其轉染后病變情況，以便更好地為臨床提供依據。