miR-218-5p靶向B細胞淋巴瘤因子3表達影響白血病K562細胞的增殖和凋亡

高娟，邢海洲

白血病是一類常見的造血干細胞惡性克隆性疾病，主要表現為克隆性白血病細胞增殖失控、分化障礙、凋亡受阻進而導致其在骨髓和其他造血組織中大量累積，浸潤其他非造血組織和器官，同時抑制正常造血功能。因此，如何有效的抑制白血病細胞的增殖促進其凋亡對白血病的治療意義重大。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類具有18～22 個核苷酸的非編碼小RNA，在白血病的診斷、預后和治療中發揮著重要作用［1-2］。微小RNA-218-5p（miR-218-5p）是近年的研究熱點miRNA，研究發現，miR-218-5p 在白血病病人中表達下調，過表達miR-218 通過靶向SNX4抑制白血病細胞增殖和侵襲，但miR-218-5p在白血病中的作用機制尚未完全闡明［3-4］。生物信息學分析顯示，B細胞淋巴瘤因子3基因（B-cell CLL/lymphoma 3，BCL3）能夠和miR-218-5p 相互作用，BCL3最初發現于B淋巴細胞白血病，研究發現BCL3在白血病病人體內表達顯著上調［5］。但miR-218-5p能否靶向BCL3 參與對白血病細胞增殖和凋亡的調控尚未可知。因此，通過以下研究，以探討miR-218-5p對白血病K562細胞增殖和凋亡的影響，初步探討其作用機制，以期為白血病的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要材料和試劑 人慢性髓原白血病細胞K562購于中國科學院細胞庫；RPMI-1640培養基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗、噻唑藍（MTT）試劑盒購于美國Gibco 公司；LipofectamineTM2000 購于美國Invitrogen公司，總RNA提取試劑盒購于上海生工生物工程有限公司；模擬物陰性對照（miR-con）、miR-218-5p模擬物（miR-218-5p mimics）、干擾對照（si-con）、干擾BCL3（si-BCL3）、空載體（pcDNA）、過表達BCL3（pcDNA-BCL3）、抑制物對照（anti-miR-con）、抑制物miR-218-5p（anti-miR-218-5p）、BCL3 野生型熒光素酶載體（WT-BCL3）以及BCL3 突變型熒光素酶載體（MUT-BCL3）的構建由上海吉瑪制藥有限公司提供；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物技術有限公司；B 細胞淋巴瘤因子3（BCL3）兔多克隆抗體、細胞增殖抗原（Ki67）兔多克隆抗體、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）兔單克隆抗體、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Cleaved Caspase-3）兔多克隆抗體購于美國Abcam 公司；山羊抗兔Ⅱ抗購于廣西銳博生物科技技術有限公司。

1.1.2 樣本收集 白血病骨髓樣本20例來源于2016年1月至2018年1月鄭州大學第一附屬醫院的住院病人，所有病人均在其初診時采集其骨髓標本。另取同時期10例正常骨髓捐獻者骨髓標本為對照組。本研究在術前病人或其近親屬均簽署知情同意書，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養、轉染和分組 將K562細胞接種于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養基，于37 ℃、二氧化碳體積分數為5%的細胞培養箱進行細胞培養。按照1∶3比例傳代培養，選取對數期細胞進行后續研究。按照每孔5×103個K562細胞接種于96孔板，按照LipofectamineTM2000 使用說明分別將miR-con、miR-218-5p mimics、si-con、si-BCL3轉染至K562 細胞，依次標記為miR-con 組、miR-218-5p 組、si-con組、si-BCL3組，轉染6 h更換培養液，轉染48 h用胰蛋白酶消化收集細胞，進行后續實驗分析。此外，正常培養的K562 細胞標記為NC 組（對照組）。為進一步驗證miR-218-5p 是通過調控BCL3 表達影響白血病細胞的增殖和遷移，進行回復實驗，將miR-218-5p mimics 分別與pcDNA 或pcDNA-BCL3共轉染K562 細胞，分別標記為miR-218-5p+pcDNA組和miR-218-5p+pcDNA-BCL3 組檢測K562 細胞的增殖和凋亡變化。

1.2.2 RT-qPCR 檢測 取轉染48 h 的各組K562 細胞，按照TRIzol 總RNA 提取試劑盒提取各組細胞的總RNA，檢測總RNA 純度后，采用一步法RT-PCR試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，最后將cDNA 進行實時熒光定量PCR，利用2-ΔΔCT法計算miR-218-5p 和BCL3 mRNA的相對表達水平。引物序列如下：miR-218-5p 正向引物 5’-TTGCGGATGGTTCCGTCAAGCA-3’，反向引物5’-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’；U6 正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；BCL3 正向引物5’-GAAAACAACAGCCTTAGCATGGT-3’，反向引物5’-CTGCGGAGTACATTTGCG-3’；β-actin 正向引物5’-CCAACCGCGAGAAGATGA-3’，反向引物 5’-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3’。

1.2.3 MTT 法檢測細胞增殖活力 轉染48 h 時，各取一組K562 細胞，向每孔內加入終濃度為5 mg/mL的MTT 試劑20 μL，培養箱孵育4 h，向每孔內加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，培養箱繼續孵育2 h 至結晶充分溶解，用酶標儀于波長490 nm 處測定各孔的吸光度值，計算細胞存活率。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 轉染48 h 后，胰蛋白酶消化細胞，用預冷的PBS 液洗滌細胞2 次，離心收集細胞。加入適量的1×結合緩沖液懸浮細胞，調整細胞濃度約為1×106個/毫升，取100 μL 細胞懸液加入流式管內，加入5 μL Annexin V-FITC，室溫避光，輕輕地混勻10 min，再加入5 μL 的PI，室溫避光孵育5 min，補加PBS 液至500 μL，混勻后，1 h 內用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測 轉染48 h后，收集各組細胞，加入細胞裂解液于冰上裂解30 min，離心收集上清液即為細胞總蛋白。采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，煮沸5 min 使其充分變性，隨后進行上樣和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），利用濕法轉膜裝置將細胞蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。室溫條件5%脫脂牛奶封閉1 h；Ⅰ抗溶液4 ℃孵育過夜；二抗室溫條件孵育1 h；凝膠成像系統曝光后分析目的條帶的灰度值。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測 采用生物信息學軟件targetscan 進行靶基因預測顯示，BCL3 的3’-UTR 含有與miR-218-5p 的互補配對的核苷酸序列，BCL3 是miR-218-5p 的潛在靶基因。利用LipofectamineTM2000 將BCL3 野生型熒光素酶報告基因載體WT-BCL3 和突變型熒光素酶報告基因載體MUT-BCL3 分別與miR-218-5p mimics 或miR-con 共轉染K562 細胞，轉染48 h 后，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒分析各組細胞的熒光素酶活性。

1.3 統計學方法采用SPSS 17.0 軟件對計量資料進行統計學處理，兩組間數據比較采用獨立樣本t檢驗進行分析，多組間間數據比較用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-218-5p和BCL3白血病骨髓細胞和正常人骨髓細胞中的表達圖1、表1、表2顯示，與正常人骨髓細胞相比，白血病骨髓細胞中miR-218-5p的表達水平顯著降低，BCL3 mRNA和BCL3蛋白的表達水平顯著升高；與人正常骨髓基質細胞HS-5比較，K562細胞中miR-218-5p的表達水平顯著降低，BCL3 mRNA和BCL3蛋白的表達水平顯著升高（P＜0.001）。

圖1 蛋白質印跡法檢測白血病骨髓細胞和正常人骨髓細胞中BCL3表達

表1 檢測白血病骨髓細胞和正常人骨髓細胞中miR-218-5p和BCL3表達/

表1 檢測白血病骨髓細胞和正常人骨髓細胞中miR-218-5p和BCL3表達/

注：miR-218-5p 為微小-218-5p，BCL3 mRNA 為B 細胞淋巴瘤因子3 基因mRNA，BCL3 protein 為B 細胞淋巴瘤因子3 基因蛋白，Normal為正常人骨髓細胞，Cancer為白血病骨髓細胞。

表2 檢測人正常骨髓基質細胞HS-5和白血病K562細胞中miR-218-5p和BCL3表達/

表2 檢測人正常骨髓基質細胞HS-5和白血病K562細胞中miR-218-5p和BCL3表達/

注：miR-218-5p 為微小-218-5p，BCL3 mRNA 為B 細胞淋巴瘤因子3基因mRNA，BCL3 protein為B細胞淋巴瘤因子3基因蛋白，HS-5為人正常骨髓基質細胞，K562為白血病細胞。

2.2 miR-218-5p抑制白血病K562細胞增殖和誘導細胞凋亡圖2、表3 顯示，與NC 組和miR-con 組比較，miR-218-5p組白血病K562細胞miR-218-5p的表達水平顯著升高（P＜0.001），表明過表達miR-218-5p的K562 細胞株構建成功。與NC 組和miR-con 組比較miR-218-5p 組白血病K562 細胞Cyclin D1 和Ki67蛋白的表達水平顯著降低，Cleaved-Caspase-3的表達水平顯著升高，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.001）。提示，過表達miR-218-5p抑制白血病K562細胞增殖，誘導細胞凋亡。

圖2 蛋白質印跡法檢測白血病K562細胞Ki67、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表達（A）和流式細胞術檢測白血病K562細胞凋亡（B）

表3 上調miR-218-5p表達對白血病K562細胞增殖和細胞凋亡的影響/

表3 上調miR-218-5p表達對白血病K562細胞增殖和細胞凋亡的影響/

注：NC 為對照組，miR-con 為模擬物陰性對照，miR-218-5p 為miR-218-5p 模擬物，Ki67 為細胞增殖抗原，CyclinD1 為細胞周期蛋白D1，Cleaved Caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。①與miR-con組比較，P＜0.001。

2.3 miR-218-5p 靶向BCL3 調控其表達生物信息學軟件targetscan 在線預測顯示，miR-218-5p 和BCL3 的3’-UTR 存在部分連續的特異性結合位點，見圖3。表4顯示，與miR-con和WT-BCL3共轉染組比較，miR-218-5p 和WT-BCL3 共轉染組K562 細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.001）；與miR-con 和MUT-BCL3共轉染組比較，miR-218-5p和MUT-BCL3共轉染組K562 細胞熒光素酶活性變化無統計學意義。表5 顯示，與miR-con 組比較，miR-218-5p 組K562 細胞BCL3 蛋白的表達水平顯著降低；與antimiR-con 組比較，anti-miR-218-5p 組K562 細胞BCL3蛋白的表達水平顯著升高（P＜0.001）。以上結果提示，BCL3 是miR-218-5p 的靶基因，miR-218-5p 可靶向負性調控BCL3表達。

表4 雙熒光素酶報告實驗/

表4 雙熒光素酶報告實驗/

注：WT-BCL3 為BCL3 野生型熒光素酶載體，MUT-BCL3 為BCL3突變型熒光素酶載體。

表5 miR-218-5p調控BCL3的表達/

表5 miR-218-5p調控BCL3的表達/

注：BCL3 為B 細胞淋巴瘤因子3，miR-con 為模擬物陰性對照，miR-218-5p 為miR-218-5p 模擬物，anti-miR-con 為抑制物對照，antimiR-218-5p為抑制物miR-218-5p。①與miR-con 組比較，P＜0.001。②與anti-miR-con 組比較，P＜0.001。

圖3 miR-218-5p與BCL3互補的核苷酸序列（A）及miR-218-5p調控BCL3表達（B）

2.4 沉默BCL3 表達抑制白血病K562 增殖和誘導細胞凋亡圖4、表6 顯示，與NC 組和si-con 組比較，si-BCL 組K562 細胞BCL3 的表達水平顯著降低，表明沉默BCL3 的K562 細胞株構建成功。與NC組和si-con組比較，si-BCL 組K562細胞Cyclin D1 和Ki67 蛋白的表達水平顯著降低，Cleaved-Caspase-3 的表達水平顯著升高，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.001）。提示，沉默BCL3 抑制白血病K562 細胞增殖，誘導細胞凋亡。

表6 沉默BCL3表達對白血病K562細胞增殖和凋亡的影響/

表6 沉默BCL3表達對白血病K562細胞增殖和凋亡的影響/

注：NC 為對照組，si-con 為干擾對照，si-BCL3 為干擾BCL3，BCL3 為B 細胞淋巴瘤因子3，Ki67 為細胞增殖抗原，CyclinD1 為細胞周期蛋白D1，Cleaved Caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。①與si-con組比較，P＜0.001。

圖4 蛋白質印跡法檢測沉默BCL-3表達對白血病K562細胞BCL3、Ki67、Cyclin D1和Cleaved Caspase-3表達的影響

2.5 過表達BCL3 部分逆轉miR-218-5p 對白血病細胞K562 增殖和凋亡的影響圖5、表7 顯示，與miR-con組比較，miR-218-5p 組K562 細 胞BCL3、Ki67和Cyclin D1蛋白的表達水平顯著降低，Cleaved Caspase-3 蛋白的表達水平顯著升高，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高；與miR-218-5p+pcDNA 組比較，miR-218-5p+pcDNA-BCL3 組K562 細胞BCL3、Ki67 和Cyclin D1 蛋白的表達水平顯著升高，Cleaved Caspase-3蛋白的表達水平顯著降低，細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低（P＜0.001）。提示，過表達BCL3能夠部分逆轉miR-218-5p對白血病細胞K562增殖和凋亡的影響。

表7 過表達BCL3表達部分逆轉miR-218-5p對白血病K562細胞增殖和凋亡的影響/

表7 過表達BCL3表達部分逆轉miR-218-5p對白血病K562細胞增殖和凋亡的影響/

注：miR-con 為模擬物陰性對照，miR-218-5p 為miR-218-5p 模擬物，miR-218-5p+pcDNA 為miR-218-5p 模擬物+空載體，miR-218-5p+pcDNA-BCL3 為miR-218-5p 模擬物+過表達BCL3，BCL3 為B 細胞淋巴瘤因子3，Ki67 為細胞增殖抗原，CyclinD1 為細胞周期蛋白D1，Cleaved Caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。①與miR-con組比較，P＜0.001。②與miR-218-5p+pcDNA組比較，P＜0.001。

圖5 蛋白質印跡法檢測過表達BCL3 部分能逆轉miR-218-5p對白血病K562細胞BCL3、Ki67、Cyclin D1和Cleaved Caspase-3表達的影響

3 討論

白血病是一種常見的血液系統惡性腫瘤，近年來其發病率呈升高趨勢［6］。骨髓移植作為白血病病人最有效的治療手段，卻存在供體難求、費用昂貴、并發癥導致的死亡風險高等特點［7-8］。因此，探索新的白血病治療策略勢在必行。

近年來，大量的研究表明，miRNA在白血病的發生發展中發揮關鍵作用。miR-148b在急性髓系白血病病人及細胞系中的表達水平顯著降低，過表達miR-148b 可引起細胞周期G0 至G1 期阻滯，細胞增殖受到抑制，細胞凋亡率增加［9］；miR-320c在白血病病人中顯著低表達，miR-320c 表達水平升高是白血病病人預后良好的獨立因素，過表達miR-320c 可通過調控磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路抑制白血病細胞活性和克隆形成能力，誘導細胞凋亡，發揮抑癌基因作用［10］。近年來，miR-218-5p被報道在多種人類惡性腫瘤中具有抑癌基因作用。miR-218-5p 在胃癌組織中表達降低，miR-218-5p 低表達與胃癌晚期、淋巴結轉移和預后不良有關，過表達miR-218-5p 在體內可抑制胃癌細胞的增殖，誘導細胞G1期停滯，抑制腫瘤生長和轉移［11］；miR-218-5p 在前列腺癌中表達下調，過表達miR-218-5p 抑制前列腺癌裸鼠異種移植瘤的生長，抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移，促進癌細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用［12］。在白血病中，miR-218-5p 也是一種潛在的腫瘤抑制因子，但miR-218-5p 影響白血病進展的機制尚未完全闡明。為探討miR-218-5p在白血病中的作用機制，本研究首先對白血病病人骨髓細胞和正常人骨髓細胞miR-218-5p的表達水平進行檢測，結果顯示miR-218-5p 在白血病病人骨髓細胞中表達下調，與相關研究結論相吻合［13］。選取K562細胞進行功能實驗發現，過表達miR-218-5p 可顯著抑制Cyclin D1和Ki67蛋白表達，促進Cleaved-Caspase-3 表達，抑制白血病K562 細胞增殖，誘導細胞凋亡。提示，上調miR-218-5p是白血病的潛在治療靶點。

為進一步揭示miR-218-5p調控白血病細胞增殖和凋亡的分子機制，采用生物學信息軟件進行預測靶基因，發現BCL3的3’-UTR存在miR-218-5p的部分結合位點。隨后采用雙熒光素酶報告基因證實BCL3是miR-218-5p的靶基因，Western blotting檢測顯示miR-218-5p可負性調控BCL3表達。BCL3是一種原癌基因，BCL3的表達失調與乳腺癌和非小細胞肺癌等實體腫瘤的進展有關［14-15］。BCL3在宮頸癌組織中表達上調，BCL3陽性表達與不良預后特征及生存率降低有關，下調BCL3抑制宮頸癌模型小鼠異種移植瘤的生長［16］；BCL3在卵巢癌中呈高表達，BCL3可促進程序性死亡配體1表達，增強卵巢癌細胞的存活、增殖和遷移能力［17］；此外，BCL3高表達與急性髓系白血病病人生存期短密切相關［5］此外，BCL3的表達水平與膠質瘤病人的總生存期顯著相關，BCL3高表達預示腫瘤復發風險增加和預后較差［18］。本研究顯示，BCL3在白血病病人骨髓細胞中表達上調，沉默BCL3可抑制白血病K562 細胞增殖，誘導細胞凋亡，與過表達miR-218-5p抑制BCL3的作用一致。進一步研究發現，過表達BCL3可逆轉miR-218-5p對白血病K562細胞增殖和凋亡的影響。提示miR-218-5p在白血病中起抑癌基因作用，通過靶向下調BCL3表達來影響白血病細胞的增殖和凋亡。然而，miR-218-5p下游靶基因眾多［19-20］，后續將對其他靶基因進行研究，全面揭示miR-218-5p對白血病細胞增殖和凋亡的調控作用。

綜上所述，miR-218-5p 在白血病中表達下調，BCL3 表達上調，miR-218-5p 通過靶向調控BCL3 表達抑制白血病細胞增殖、促進細胞凋亡。本研究的發現為白血病的臨床治療指明了方向，miR-218-5p有望成為白血病的分子治療靶點。