長鏈非編碼RNA H19在肺炎支原體肺炎病兒血清中的表達及其意義

秦小菀，高偉霞，陳樸

肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是一種急性呼吸道感染性疾病，近年來，MPP 發病率逐年升高，而肺炎支原體是引起肺部感染的重要原因［1-2］。MPP 發病機制尚未完全闡明，既往研究顯示微小RNA（microRNA，miRNA）等非編碼RNA 在MPP 發病過程中發揮重要作用［3］。長鏈非編碼RNA H19（LncRNA H19）在急性胰腺炎病人血清中表達水平升高，并可能作為有效診斷指標［4］。研究表明LncRNA H19 在氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導的內皮細胞中呈高表達并可能參與內皮細胞損傷過程［5］。但LncRNA H19 在MPP 病兒中的表達及其臨床意義尚未闡明。因此，本研究首先檢測MPP 病兒血清中LncRNA H19 的表達水平，分析其對MPP 的診斷價值，其次通過體外培養小鼠肺泡巨噬細胞MH-S，探討LncRNA H19 表達狀態對MH-S 細胞凋亡及炎性因子表達的影響及其可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017 年10 月至2018 年12 月南陽市中心醫院收治的MPP病兒60例為觀察組，所有病兒均符合MPP診斷標準［6］。經實驗室檢查確診為MPP，其中男30例，女30例，年齡范圍1～10歲，年齡（5.62±2.32）歲。根據病兒病情程度分為恢復期（30 例）與急性期（30 例）。MPP 病兒近期均未服用糖皮質激素藥物；未服用免疫抑制劑藥物；未合并免疫系統疾病；未合并其他感染性疾病；未合并支氣管哮喘等疾病。選取同期到我院體檢的健康兒童60 例作為對照組，其中男40 例，女20 例，年齡范圍1～10歲，年齡（5.58±3.11）歲。兩組研究者一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 小鼠肺泡巨噬細胞MH-S 購自上海雅吉生物科技有限公司；DMEM、胎牛血清購自美國Gibco 公司；Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司；LncRNA H19小干擾RNA（si-H19）、亂序無意義陰性序列（si-NC）購自上海吉瑪制藥有限公司；兔抗鼠GAPDH 抗體購自美國CST 公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自美國Sigma公司；ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.2.2 采集樣本 采集各組受試者空腹靜脈血5 mL，吸取上清，置于-20 ℃保存備用。

1.2.3 qRT-PCR 檢測LncRNA H19 的表達水平采用Trizol 法提取總RNA，參照反轉錄試劑盒合成cDNA。以cDNA 為模板進行qRT-PCR 反應，反應條件：95 ℃、60 s，95 ℃、60 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40 次循環。采用2-ΔΔCt法計算LncRNA H19 相對表達量。

1.2.4 細胞處理與實驗分組 參考相關文獻提取肺炎支原體脂質相關膜蛋白（LAMPS），置于-80 ℃超低溫冰箱內保存［7］。取出凍存MH-S細胞，在含有10%胎牛血清的DMEM 培養基培養，待細胞生長至80%融合時，進行傳代培養。取對數期MH-S 細胞，使用2 μg/mL的LAMPS處理24 h［8］，記作LAMPS組。同時將未經處理的細胞作為對照組。根據Lipofectamine 2000試劑盒說明書分別將si-NC、si-H19轉染至MH-S 細胞，使用2 μg/mL 的LAMPS 處理24 h，分別記作si-NC組、si-H19組。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集各組MH-S 細胞，加入500 μL Binding Buffer 懸浮細胞，依次加入5 μL Annexin V-FITC 與5 μL PI，充分混勻，室溫避光孵育10 min，置于流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.6 ELISA 法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）水平收集各組細胞培養上清液，采用ELISA 法檢測炎性因子水平。

1.2.7 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測B 淋巴細胞瘤-2 相關蛋白（Bax）、細胞色素C（Cyt C）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）蛋白表達 收集各組MH-S 細胞，根據BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。行SDS-PAGE 電泳，將分離的蛋白轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗稀釋液（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加入二抗稀釋液（1∶2 000），室溫孵育1 h，暗室內曝光顯影，應用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統計學方法采用SPSS 21.0 進行分析，計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清LncRNA H19 表達比較與對照組相比，觀察組病人血清LncRNA H19 的表達水平顯著升高（1.01±0.13）比（2.58±0.25）（P＜0.05）；與MPP恢復期病人相比，MPP 急性期病人血清LncRNA H19的表達水平顯著升高（1.63±0.20）比（3.24±0.39）（F=739.16，P＜0.05）。

2.2 LncRNA H19 對MPP 的診斷價值ROC 分析LncRNA H19 對MPP 的診斷價值，結果顯示LncRNA H19 在MPP 診斷中敏感度為86.67%，特異度為86.67%，AUC 面積為0.869，95%CI：0.795～0.924，截斷值為1.36，見圖1。

圖1 LncRNA H19對肺炎支原體肺炎的ROC分析圖

2.3 LAMPS誘導的肺泡巨噬細胞中LncRNA H19的表達量與對照組相比，LAMPS 組細胞中LncRNA H19的表達水平顯著升 高（1.02±0.16）比（2.57±0.24）（t=16.12，P＜0.05）。

2.4 沉默LncRNA H19 對LAMPS 誘導的肺泡巨噬細胞凋亡的影響與對照組相比，LAMPS 組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與si-NC 組相比，si-H19 組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖2、表1。

表1 沉默LncRNA H19對LAMPS誘導的肺泡巨噬細胞凋亡的影響/

表1 沉默LncRNA H19對LAMPS誘導的肺泡巨噬細胞凋亡的影響/

注：LAMPS 為肺炎支原體脂質相關膜蛋白，si-NC 為亂序無意義陰性序列，si-H19為LncRNA H19小干擾RNA，Bax為B淋巴細胞瘤-2相關蛋白，Cyt C 為細胞色素C；Cleaved Caspase-3為活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3。①與對照組相比，P＜0.05。②與si-NC組相比，P＜0.05。

圖2 肺泡巨噬細胞凋亡：A為流式細胞術檢測細胞凋亡；B為細胞凋亡相關蛋白免疫印跡圖

2.5 沉默LncRNA H19 對LAMPS 誘導的肺泡巨噬細胞炎性因子的影響與對照組相比，LAMPS 組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平顯著升高（P＜0.05）；與si-NC組相比，si-H19 組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 沉默LncRNA H19對LAMPS誘導的肺泡巨噬細胞炎性因子的影響/（pg/mL，）

表2 沉默LncRNA H19對LAMPS誘導的肺泡巨噬細胞炎性因子的影響/（pg/mL，）

注：LAMPS 為肺炎支原體脂質相關膜蛋白，si-NC 為亂序無意義陰性序列，si-H19 為LncRNA H19 小干擾RNA，TNF-α 為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白細胞介素-1β，IL-6為白細胞介素6。①與對照組相比，P＜0.05。②與si-NC組相比，P＜0.05。

3 討論

肺泡巨噬細胞可維持肺部正常環境，并可抑制炎癥反應及清除肺組織內細胞碎片等，研究表明LAMPS 可通過與巨噬細胞表面部分受體結合從而激活相關炎性信號通路從而釋放炎性因子［9-10］。巨噬細胞異常凋亡也可促進炎癥遞質的釋放從而促進MPP進展［11-12］。但肺泡巨噬細胞損傷的分子機制尚未闡明。

沉默LncRNA H19 通過上調miR-130b 而抑制經ox-LDL 誘導的炎癥反應［13］。研究表明LncRNA H19可增強幽門螺桿菌感染誘導的炎癥反應從而促進胃癌細胞的生長［14］。相關報道指出LncRNA H19通過發揮本身的作用可增加血管炎性水平［15］。這個報道與本研究結果類似。本研究結果顯示MPP病兒血清中LncRNA H19 的表達水平顯著升高，急性期病兒血清LncRNA H19 的表達水平高于恢復期，提示LncRNA H19 表達量升高可能促進MPP 的發生及發展。本研究通過ROC分析LncRNA H19對MPP 的診斷價值，結果顯示LncRNA H19 在診斷MPP 時的靈敏度與特異度較高，提示LncRNA H19對MPP 具有一定診斷價值。綜合上述實驗結果證實LncRNA H19可能作為臨床診斷MPP的分子標志物，還可能用于判斷疾病進展。同時本研究采用LAMPS 處理肺泡巨噬細胞建立細胞損傷模型，結果顯示細胞中LncRNA H19 的表達水平顯著升高，進一步分析顯示LAMPS 處理后肺泡巨噬細胞的凋亡率明顯升高，而沉默LncRNA H19 表達后細胞凋亡率顯著降低，提示沉默LncRNA H19表達可明顯抑制LAMPS誘導的肺泡巨噬細胞凋亡［16］。本研究結果顯示，沉默LncRNA H19 表達可抑制LAMPS 誘導的肺泡巨噬細胞凋亡。炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高可參與多種疾病發生過程，研究表明TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高可破壞肺泡上皮細胞及血管內皮細胞［17-19］。本研究結果顯示LAMPS 處理肺泡巨噬細胞后，炎性因子明顯上調，而沉默LncRNA H19 表達可明顯下調炎性因子水平，提示沉默LncRNA H19表達可抑制LAMPS誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應。

綜上所述，LncRNA H19 在MPP 病兒血清中呈高表達，并可作為診斷與評估MPP 病情的分子標志物，體外細胞實驗中，沉默LncRNA H19 表達可明顯降低LAMPS誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應，抑制細胞凋亡，可為臨床預防及治療MPP 提供新思路。但LncRNA H19 在MPP 發生發展過程中的調控機制仍需進一步探討。