液體培養法與熒光探針PCR 檢測陰道分泌物中解脲脲原體的應用價值

王敏，萬曉龍

1.江蘇省東臺市人民醫院檢驗科，江蘇東臺 224200；2.江蘇省東臺市人民醫院兒科，江蘇東臺 224200

支原體（mycoplasma）是最小的原核細胞型微生物，無細胞壁，形態多樣，可自細菌濾器濾過，生長繁殖于無生命培養基中[1-2]。目前，能夠從人體分離出的支原體共有16 種，其中7 種對人體有致病性，以解脲脲原體（ureaplasma urealyticum, UU）、人型支原體（mycoplasma hominis，Mh）最為常見[3-4]。可通過性接觸傳播，引起人類非淋球菌性和非衣原體性泌尿生殖道感染， 引起婦科疾病與不良妊娠結局[5-6]。目前，對UU 檢測臨床實驗室多采用液體培養基法，可直接檢測細菌。另外，還可使用核酸檢測的方法檢測UU[7-8]?；诖耍疚倪x取江蘇省東臺市人民醫院檢驗科2019 年1 月—2021 年12 月收治的138 例疑似泌尿生殖道感染者，分別采用液體培養法、熒光探針PCR 法檢測，對檢測結果進行方法學對比，并探討聯合方式對疾病的診斷價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院檢驗科的138 例疑似泌尿生殖道感染的女性患者，年齡20～58 歲，病程2～12 個月。臨床癥狀：白帶增多、混濁、子宮頸水腫、充血或表面糜爛；累及尿道可見尿道口潮紅、充血；擠壓尿道可見分泌物外溢[9]。本研究所選病例經過醫院醫學倫理委員會批準，患者或家屬知情同意。

1.2 納入與排除標準

納入標準：年齡22～50 歲；狀態良好，主動配合研究；資料完整，數據真實可靠。

排除標準：重要臟器功能受損者；惡性腫瘤患者；合并其他感染性疾病者；近期有過相關治療者；妊娠或哺乳期女性。

1.3 方法

所用儀器為ABI 7500 實時熒光定量PCR 分析儀。解脲脲原體核酸檢測試劑盒為圣湘生物科技股份有限公司生產。

陰道分泌物檢測金標準為Amsel 臨床標準[10]，需滿足下列4 項中的其中3 項：線索細胞陽性（即數量占陰道上皮細胞總量的20%以上；胺試驗陽性；陰道分泌物pH 值＞4.5；陰道分泌物稀薄、灰白色，且質地均勻；必備條件為線索細胞陽性。

以錯誤分析理論為指導，分析學生的在筆譯過程產生的語言錯誤，教師不僅可以把握學生的英語發展的不同階段，同時也能認識自身翻譯教學過程中的問題。更為重要的是，錯誤分析有助于檢驗學生譯文的語言知識點、百科知識以及文化知識的不足，這樣教師才能及時調整教學模式，學生也能調整自己的學習策略?？傊缈频轮赋龅哪菢印板e誤研究方法，作為是了解語言學習過程中的必要方法，它有助于我們了解語言學習者的語言變化過程，還能反映出我們的學習者處于怎樣一個語言學習階段中”。[17]

1.3.2 液體培養基培養取出所需數量的冷凍干燥培養基，滴加少量稀釋液到培養瓶中，充分搖勻至培養基完全溶解。補充滴加稀釋液，使液面至標簽標線處。在試劑條空白孔中加入50 μl 液體培養基。將采集的樣本插入培養基中，擠壓旋轉拭子數次，使拭子中分泌物洗脫后棄拭子。充分混勻接種后的液體培養基，分別取50 μl 接種到試劑條余下各孔中。在試劑條的每1 孔中滴加1 滴石蠟油，蓋上蓋子。將剩余培養基連同試劑條放置35～37℃培養箱中孵育。

1.3.1 樣本采集所有患者采樣前2 h 內不能排尿。采樣時，先清潔宮頸口過多的分泌物，將女性用無菌藻酸鈣拭子深入宮頸內2～3 cm，用力轉1～2 圈后取出拭子。取出的分泌物應略帶黏膜，采集后的拭子置入無菌收集管中密封，立即送檢。每位患者需取兩份陰道分泌物樣本。

采用SPSS 22.0 統計學軟件處理數據，計數資料以頻數與百分比（%）表示，P＜0.05 為差異有統計學意義。

金標準顯示：138 例疑似患者中，確診患者110例；單一診斷方式特異性對比，差異無統計學意義（P＞0.05）；液體培養基培養法靈敏度和準確率高于熒光探針PCR 法，差異有統計學意義（P＜0.05）；與單一診斷方式比較，聯合診斷靈敏度、特異度和準確率更高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

綜上所述,新生兒護理具有特殊性,而有效的安全護理有助于最大程度消除新生兒臨床不安全因素,降低不安全事件的發生率,需要臨床重視。

1.4 統計方法

核桃是我國能在國際市場上站穩腳跟的少數農副產品之一，特別是核桃油價格可達66元/kg，加之，核桃生產成本低，投入與產出比是1∶5，核桃果加工成仁能增值0.25倍，加工成油能增值2.5倍，加工成飼料能增值8倍，且收獲期長達60多年，產量穩定，所以，核桃產業具有廣闊的發展前景。

1.3.3 熒光探針PCR 檢測解脲脲原體核酸按照試劑說明書要求，取出試劑盒各組分平衡至室溫，混勻后備用；根據待測樣本數量，按比例混合反應液、酶混合液和內標配制PCR 混合液，瞬時離心后備用；每孔PCR 反應管中加入核酸釋放劑5 μl 后，分別加入待測樣本、陰性對照、陽性對照各5 μl；加PCR 混合液40 μl 至每孔后，蓋上管蓋，2 000 rpm 離心30 s；設置PCR 循環參數進行擴增，PCR 反應條件為：50℃UNG 酶處理2 min，94℃預變性5 min，94℃變性15 s、57℃退火延伸30 s（共45個循環），25℃冷卻10 s；測定Ct 值≤38.5，擴增曲線呈典型S 型，同時內標Ct值≤40，為解脲支原體陽性。

液體培養基培養法報告獲取時間為（47.78±2.16）h，明顯長于熒光探針PCR 法的(25.12±1.44）h，差異有統計學意義（t=102.540，P＜0.001）。

2 結果

2.1 液體培養基培養和熒光探針PCR 兩種檢測方法結果的比較

以Amsel 臨床診斷標準為金標準，液體培養基培養法對UU 的檢出率為76.09%，高于熒光探針PCR 法的57.25%，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩種檢測方法結果的比較

2.2 單一檢測與聯合檢測的診斷價值比較

當有解脲脲原體生長時，24 h 觀察培養基由黃色變成紅色；當有人型支原體生長時，48 h 觀察培養基由黃色變成紅色。空白孔陰性表示試驗結果有效，可對其余各孔結果予以判定；空白孔陽性表示試驗過程中有污染，結果無效。

表2 單檢測與聯合檢測的診斷價值比較

2.3 兩種檢測方法報告獲取時間比較

2.3.1 HCC 結果(表2、表3)顯示：388例HCC患者中，腫瘤大小、腫瘤數目、γ-GGT水平、肝硬化、血管侵犯、BMI(消瘦與否)是影響術后總體生存的獨立因素(P<0.05)；腫瘤數目、γ-GGT水平、肝硬化、血管侵犯、BMI(消瘦與否)是影響術后復發的獨立因素(P<0.05)。

3 討論

本研究中熒光探針PCR 法解脲脲原體的檢出率為57.25%，低于液體培養法的76.09%，差異有統計學意義（P＜0.05）。造成檢出率差異的原因可能為：①解脲支原體的兩個亞型微小脲原體（ureaplasma parvum, Up）與解脲脲原體都能分解尿素，使培養酚紅指示劑變紅，因此液體培養法無法區分[11]。②液體培養基中所含抗菌藥物不能完全抑制陰道分泌物中復雜多樣的微生物，也可造成假陽性。③液體培養基法通過檢驗人員的肉眼判讀結果，易出現主觀因素導致的隨機誤差[12-13]。而熒光探針PCR 法可針對UU 設計特異性引物進行單項檢測，假陽性概率較低。除具有較強的特異性之外，熒光探針PCR 法還有較高的敏感性，最低檢出量僅為400 copies/mL；檢測時間短，只需數小時便可完成；污染率低，僅需加樣時開蓋，全封閉狀態操作等方法學的優點，是目前臨床實驗室廣為應用的一種新型病原微生物檢測技術[14]。

北方的冬天，有著純潔的美。夜間下雪時，我總愛站在街燈下，頭向上仰望著，眼睛努力睜大，看著被燈光折射過的飛雪，雪花調皮地打在臉上，有些滲入衣服里，一陣冰涼的感覺傳來，可我卻感覺不到冷。路上的行人很少，雪地上只有一些稀稀疏疏的腳印，也許是因為都不忍心破壞這純潔無暇的美麗風景吧。眼前的路是一片潔白，似乎已經鋪上了一條白地毯。雪花不時地飄到我的臉上，抬頭望去，每一片飛舞的雪花，在燈光的映射下，仿佛就是一簇簇從天上灑下來的銀屑。

傳統的液體培養法雖然方法學特異性不如熒光探針PCR 法，但其所檢測的只能是陰道分泌物標本中的活體支原體，可為疾病準確診斷以及療效跟蹤觀察提供實驗基礎。與此同時，該檢測方法操作相對簡單，還可檢測人型支原體，也是臨床實驗室不可或缺的解脲脲原體檢測手段[15]。學者馮米妹等[16]在研究中發現，液體培養法的檢出率為90.28%,明顯高于PCR 法的77.78%（P＜0.05），與文中結果一致。

文中對比聯合方式對疾病的診斷價值，結果顯示液體培養基培養法聯合熒光探針PCR 法對疾病的診斷靈敏度、特異度和準確率高于單一診斷方式（P＜0.05），由此可見，解脲脲原體感染時，只選擇一種檢測方法有一定的局限性，而聯合傳統的液體培養法和熒光探針PCR 法兩種方法同時檢測，快速準確地鑒定解脲脲原體，也可在此基礎上準確診斷疾病，還能夠為療效監測提供依據，優勢互補更有利于指導臨床UU 感染的診斷和治療[17-18]。兩組報告獲取時間對比結果顯示，熒光探針PCR 時間更短（P＜0.05），24 h 左右即可獲得檢測結果，可為疾病早期診斷提供更為可靠的依據，便于疾病治療工作盡早開展，緩解患者壓力。

綜上所述，液體培養基培養法和熒光探針PCR均可用于解脲脲原體感染診斷，二者聯合，可進一 步提高診斷價值。