Xpert MTB/RIF 與改良羅氏比例法藥敏試驗檢測利福平藥敏的臨床價值

汪芹，紀小亭，黃鑫，曾東曉，秦安東，劉興祥

淮安市第四人民醫院醫學檢驗科，江蘇淮安 223001

結核病是通過呼吸道傳播的一種傳染病，也是世界公認的一種感染性疾病，仍是全球前10 位死因之一。結核病疫情嚴重[1]，中國位列全球第二，僅次于印度。調查顯示，2020 年全球登記的肺結核患者480 萬例，其中59%為細菌學確診病例。2020 年全球診斷的580 萬結核病患者中，只有33%（190 萬/580 萬）使用了分子方法檢查（2019 年全球登記結核病710 萬）。近年來，由于結核病患者用藥不規范，初治或者反復治療，耐多藥結核病（multidrug resistance tuberculosis, MDR-TB）發生率越來越高。目前結核病診斷以及藥敏試驗的金標準仍是羅氏比例藥敏試驗檢測法，但培養法的陽性率低、時間長[2]，使結核患者未得到及時有效的治療。利用新技術和更先進的檢測設備如Xpert MTB/RIF、宏基因組二代測序[3]、DNA 微陣列[4]等可以及時有效的檢測出結核桿菌是否耐藥，成為結核病防治工作中當務之急[5]，為臨床治療提供更可靠的治療依據。因此，本研究選取2019 年7 月—2022 年4 月淮安市第四人民醫院246 例肺結核患者作為研究對象，對比Xpert MTB/RIF 和比例法藥敏試驗檢測利福平藥敏的臨床價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院住院或者門診肺結核患者痰液、肺泡灌洗液、胸水、組織液、膿分泌物、尿液、淋巴穿刺液和腦脊液等經培養結核分枝桿菌為陽性的246 份標本，其 中 女67 例，男179 例；年 齡6～92 歲，平 均（48.8±20.6）歲。

1.2 方法

①改良羅氏比例法藥物敏感性試驗。將收集的標本經過氫氧化鈉處理之后，接種于改良羅氏固體培養基上，常用羅琴培養基，由珠海貝索生物技術公司生產。將培養所得的純培養菌株作為受試菌株，用于結核桿菌藥敏檢測[6]，藥敏檢測步驟和結果報告按照《結核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質量保證手冊》進行。

②Xpert MTB/RIF。結核分枝桿菌rpoB 基因和突變檢測（實時熒光PCR 法）試劑盒由美國Cepheid 公司（批號1000272355）生產，Xpert MTB/RIF試驗按標準操作步驟進行。GeneXpert 以半巢式實時熒光定量PCR 技術[7]為基礎，在結核分枝桿菌特有的序列rpoB 基因上81bp 利福平耐藥核心區間（RRDR），專門設計引物和5 條探針，檢測該序列是否發生突變，進而判別是否檢測到結核分枝桿菌，再檢測其對利福平耐藥情況。敏感性=真陽性例數/（真陽性例數+假陰性例數）×100%，特異性=真陰性例數/（真陰性例數+假陽性例數）×100%。

1.3 統計方法

采用SPSS 20.0 統計學軟件處理數據，計數資料以頻數和百分率（%）表示，采用χ2檢驗；一致性計算kappa 值評定。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法檢測利福平藥敏結果比較

246 例樣本分別經Xpert MTB/RIF 和改良羅氏比例法藥敏試驗檢測利福平的耐藥率分別為14.6%（36/246）、11.4%（28/246），差異無統計學意義（χ2=1.15，P＞0.05）。見表1。

表1 Xpert MTB/RIF 和改良羅氏比例法藥敏檢測利福平藥敏結果

2.2 兩種方法檢測利福平藥敏結果符合情況比較

以改良羅氏比例法藥敏試驗為金標準，Xpert MTB/RIF 檢測利福平耐藥的敏感性為100.0%（28/28），特異性為96.3%（210/218），符合率96.7%（238/246），兩種方法一致性較好（Kappa=0.86）。見表2。

表2 Xpert MTB/RIF 和改良羅氏比例法藥敏試驗檢測利福平藥敏符合率對比

2.3 Xpert MTB/RIF 檢測利福平基因位點突變分布情況分析

Xpert MTB/RIF 檢測的246 份樣本中，檢測出36例利福平耐藥，Xpert MTB/RIF 針對結核分枝桿菌的rpoB81bp 利福平耐藥核心區間（RRDR）設計引物及5 條 探 針，包 括ProbeA(507～511)、ProbeB(512～518)、ProbeC(518～523)、ProbeD(523～529)、ProbeE(529～533)，Xpert MTB/RIF 檢測利福平耐藥位點主要以探針ProbeE（63.9%，23/36）為主，集中在位點529～533 之間，ProbeA 和ProbeB 兩個耐藥位點同時耐藥有2 例。見表3。

表3 Xpert MTB/RIF 檢測利福平基因突變情況分析

3 討論

全球感染結核菌的人群中，絕大部分人感染結核分枝桿菌后因身體抵抗力較高而不會出現明顯的癥狀，即潛伏性結核感染，常用結核菌素皮膚試驗（tuberculin skin test, TST）進行篩查[8]；少數人因免疫低[9]（如艾滋病、糖尿病患者）而出現相應的結核臨床癥狀和病灶，即活動性結核病。我國每年新發結核病人90 萬，其中耐多藥結核患者約7 萬，是高負擔結核病國家[10-12]，也是高負擔耐多藥結核病國家。利福平的單藥耐藥較少，據調查數據統計分析顯示，MDR-TB 患者中約82%為RR-TB 患者，所以利福平耐藥結核病（rifampicin resistance tuberculosis,RR-TB）[13]可作為耐多藥結核病（MDR-TB）的標志物[14-16]。所以在高科技發展的時代，利用新技術及時有效檢測結核分枝桿菌及其利福平耐藥性是重中之重。

本研究結果中，比例法藥敏試驗顯示敏感而XpertMTB/RIF 顯示耐藥有8 例，原因可能是收集的246 例標本中MTB 檢測區的基因雖發生突變，但并沒有引起耐藥表型的改變。有研究指出，主要是因rpoB 基因突變導致結核分枝桿菌耐藥，基因突變導致編碼RNA 聚合酶異常突變[17]，導致空間構象改變、氨基酸置換，導致利福平耐藥。比如，ropB 基因的533、531、526、522、516、513 或511 密碼子發生大部分突變，從而使大部分菌株有利福平的耐藥性，而密碼子507、508、517、521、523 或者532 發生突變的菌株，并不會導致比例法藥敏試驗檢測結核桿菌利福平的耐藥性。也有報道，患者感染混合菌株造成不同基因突變，這樣使利福平耐藥存在差別。

246 例患者標本檢測結果中，本研究未出現比例法藥敏試驗耐藥，而XpertMTB/RIF 敏感的病例。據報道，上述藥敏情況不符也有可能發生，原因可能為：①MTB 耐藥是由其他耐藥機制而非基因突變導致的，細菌細胞壁的通透性改變、細菌表達外排泵造成藥物的外排等。②MTB 耐藥可能由其他基因（非檢測區基因）的突變引起的。比如目前用基因法檢測inhA 和kaG 基因[18]的突變情況來判斷異煙肼是否耐藥，據研究發現，因inhA 和kaG 的基因突變產生的耐異煙肼MTB 只占到80%，還有20%可能與其他基因突變有關。

兩種方法檢測利福平是否耐藥可以指導臨床合理用藥，世界衛生組織在2014 年版《耐藥結核病規劃管理指南伙伴手冊》中指出利福平藥敏試驗包括表型藥敏試驗和基因型藥敏試驗，任何一個方法發現耐藥都需要考慮耐藥的可能性，這是由于近年有報道表型藥敏試驗為敏感，但ropB 基因突變導致耐藥，患者采用一線抗結核藥物治療時，治療結果是失敗或復發的，應該使用二線抗結核藥物[19-20]。

Xpert MTB/RIF 是一種可以高效、準確地檢測結核分枝桿菌和檢測利福平耐藥性的方法，選擇結核分枝桿菌RRDR 作為檢測區域，在該序列區域發生突變超過95%，且集中于81bp 的核心區，而敏感株rpoB 核心區序列則基本一致。因此，rpoB 核心區突變能高度提示利福平耐藥。另外，由于rpoB 核心區兩側就是結核分枝桿菌特異性基因序列。因此，Xpert MTB/RIF 檢測技術給臨床提供了快速用藥治療的可能。

綜上所述，由于抗結核藥的不規范使用或者反復治療致使結核分枝桿菌容易出現耐多藥性，結核分枝桿菌呈現耐多藥的菌株在臨床肺結核病例中出現比較頻繁，給人類帶來很大的危害。因此，應該利用現代最先進的分子生物學技術如Xpert MTB/RIF、DNA 微陣列、全基因組（WGS）測序技術等來檢測結核桿菌藥物敏感性，這樣能更及時有效地指導臨床合理用藥，避免耐藥菌株不斷的出現。完成2035 年終止結核的目標。相對于傳統培養法藥物敏感試驗檢測時間長、操作繁瑣等缺陷，XpertMTB/RIF 檢測技術具備高靈敏度、高特異性、高集成化、高通量等特性。由于MTB 耐藥是由多種機制引起的復雜過程，單純的耐藥基因檢測并不能完全反應MTB 的實際耐藥情況，所以在實際應用中應綜合考慮。