金果欖叢生芽增殖培養影響因素

黃苓芬 陸恒 謝圓圓 韋樹根 韋天如 潘麗梅

摘要??? 以金果欖組培苗為試材，研究了基礎培養基類型、不同pH、不同碳源及碳源濃度、不同瓊脂濃度對金果欖叢生芽繼代增殖培養的影響。結果表明：金果欖叢生芽繼代增殖的最優培養基為MS培養基，叢生芽增殖系數達到13.85;培養基酸堿度以pH4.5～5.0為宜，傾向于偏酸性的環境，叢生芽增殖系數達到13.22～15.27;最佳碳源為蔗糖，濃度為25 g/L;瓊脂的較佳濃度為4.5～5 g/L，在最優的組合條件下，金果欖叢生芽粗壯，增殖系數高，生長快。本研究結果為金果欖組培苗的繼代增殖及工廠化育苗提供技術支持。

關鍵詞??? 金果欖;叢生芽;培養基;pH;增殖系數

中圖分類號??? R281.4??? 文獻標識碼??? A??? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.02.011

Study on the Influence Factors of Cluster Bud Proliferation Culture of Tinospora capillipes Gagnep.

HUANG Qinfen??? LU Heng??? XIE Yuanyuan??? WEI Shugen??? WEI Tianru??? PAN Limei

（Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants，Nanning，Guangxi 530023，China）

Abstract ????Taking the tissue cultured seedling of Tinospora capillipes Gagnep. as materials，the effects of basic medium type，different pH value，different carbon source and carbon source concentration，different agar concentration on the subculture and proliferation of cluster buds of Tinospora capillipes Gagnep. were studied. The results showed that the optimal medium for the proliferation of cluster buds is MS medium，and the proliferation coefficient of cluster buds reached 13.85. The suitable pH is 4.5-5.0，which is inclined to acidic environment，and the proliferation coefficient of cluster buds is 13.22-15.27. The best carbon source is sucrose，the concentration is 25 g·L;the optimal concentration of agar is 4.5～5 g·L. Under the optimal combination conditions，the cluster buds of Tinospora capillipes Gagnep. are strong，the proliferation coefficient is high and the growth is fast. The results of this study provide technical support for the subculture and propagation of tissue culture seedlings and industrial seedling of Tinospora capillipes Gagnep.

Keywords ????Tinospora capillipes Gagnep.;cluster bud;medium;pH;proliferation coefficient

金果欖（Tinospora capillipes Gagnep.），又名地苦膽、青牛膽。野生資源主要分布在廣西、湖南、湖北、四川、貴州和云南部分地區，為我國傳統中草藥，以植株的干燥塊根入藥，具有清熱解毒、利咽、止痛之功效。因其具有良好的抗炎效果[1-3]，近年來被多家藥企重視，需求量逐年升高，因此人工種植前景看好。但金果欖雌雄異株，授粉受到環境影響極大，自然結實率低，在資源調查和引種中發現，金果欖雄株遠多于雌株（約50：1），結果機會大大減少，且種子有明顯的休眠期，發芽率較低，種子繁殖困難[4]。組織培養快速繁殖技術是應用廣泛的現代繁育技術，具有繁殖系數高、育苗速度快等優點，還能保持原植株的優良性狀，成為植物繁殖領域的優先技術[5]。課題組前期建立了金果欖組織培養技術[4]，但在金果欖的繼代增殖培養過程中發現，不同的培養基類型以及pH等對金果欖叢生芽繼代培養有不同的影響。因此本研究以金果欖組培苗為實驗材料，研究不同的培養基類型、不同pH、不同碳源、碳源濃度以及瓊脂濃度對金果欖叢生芽繼代增殖培養的影響，以期為金果欖的增殖培養及工廠化生產提供基礎數據。

1??? 材料與方法

1.1??? 材料

1.1.1??? 試材??? 試驗材料為廣西藥用植物園組培室保存的金果欖組培苗，組培苗來源于金果欖雌性植株的幼嫩莖段。

1.1.2??? 試劑??? 主要試劑包括MS培養基、White培養基、LS培養基、B5培養基、N6培養基、生長素類似物使用a-萘乙酸（NAA）、細胞分裂素使用6-芐氨基嘌呤（6-BA）;蔗糖、葡萄糖、白糖、瓊脂等。

1.2??? 方法

1.2.1?? ?試驗設計

1.2.1.1??? 不同培養基類型對金果欖叢生芽繼代增殖的影響??? 將金果欖組培苗帶腋芽的莖段接入不同類型培養基中，配制的培養基類型分別包括MS、White、LS、B5、N6共5種培養基，培養基的其余成分為6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂4.5g/L，各處理設置15瓶，每瓶接種3個帶腋芽組培苗，3次重復，培養30 d后觀察記錄叢生芽增殖系數及生長狀況。

1.2.1.2??? 不同pH對金果欖叢生芽繼代增殖的影響??? 以MS培養基為基礎培養基，將金果欖組培苗帶腋芽的莖段接入不同pH培養基中，調節pH至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5共6組處理，各處理設置15瓶，每瓶接種3個帶腋芽組培苗，3次重復，培養30 d后觀察記錄叢生芽增殖系數及生長狀況。

1.2.1.3??? 不同碳源對金果欖叢生芽繼代增殖的影響??? 以MS培養基為基礎培養基，分別加入蔗糖、葡萄糖、白糖作為碳源，各種糖用量為25 g/L，各處理設置15瓶，每瓶接種3個帶腋芽組培苗，3次重復，培養30 d后觀察記錄叢生芽增殖系數及生長狀況。

1.2.1.4??? 不同蔗糖濃度對金果欖叢生芽繼代增殖的影響??? 以MS培養基為基礎培養基，設置5個不同蔗糖濃度，分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 g/L，研究不同濃度的蔗糖對叢生芽繼代增殖的影響，各處理設置15瓶，每瓶接種3個帶腋芽組培苗，3次重復，培養30 d后觀察記錄叢生芽增殖系數及生長狀況。

1.2.1.5??? 不同瓊脂濃度對金果欖叢生芽繼代增殖的影響??? 以MS培養基為基礎培養基，試驗設置5個不同瓊脂濃度，分別為15、20、25、30、35 g/L，研究不同瓊脂濃度對叢生芽繼代增殖的影響，各處理設置15瓶，每瓶接種3個帶腋芽組培苗，3 次重復，培養30 d后觀察記錄叢生芽增殖系數及生長狀況。

以上所有處理，除了特定設置的試驗條件，其余均以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂4.5 g/L作為基礎培養基，所有處理的培養條件為：溫度（25±1）℃，光照時間12 h/d，光照強度2 500 lx。

1.2.2??? 數據處理??? 試驗數據均做3次重復，用Microsoft Office Excel和SPSS16.0對數據進行統計分析。

2??? 結果與分析

2.1??? 不同培養基類型對金果欖叢生芽繼代增殖的影響

不同培養基類型對金果欖叢生芽繼代增殖的影響見表1。由表1可以看出，不同的培養基類型對金果欖叢生芽的繼代增殖有不同的影響，其中以MS培養基的培養效果最好，叢生芽增殖系數達到13.85，顯著高于其他幾種培養基;其次是N6和B5培養基，增殖系數分別達到9.33和9.12，叢生芽生長狀態也相似;效果較差的是White培養基和LS培養基，叢生芽增殖效果一般，不適于金果欖叢生芽的增殖培養。

2.2??? 不同pH對金果欖叢生芽繼代增殖的影響

不同pH對金果欖叢生芽繼代增殖的影響見表2。由表2可以看出，不同pH對金果欖叢生芽繼代增殖有較大影響，偏酸性的環境更有利于金果欖叢生芽的繼代增殖，其中以pH 4.5～5.0較為適合，叢生芽增殖系數在13.22～15.27，顯著高于其他處理;隨著pH的升高，金果欖叢生芽的增殖系數降低，且生長狀態較差，特別是當pH達到6.5時，叢生芽增殖率低，芽細弱，葉泛黃，不利于叢生芽生長。

2.3??? 不同碳源對金果欖叢生芽繼代增殖的影響

不同碳源對金果欖叢生芽繼代增殖的影響見表3。由表3可以看出，不同碳源對金果欖叢生芽繼代增殖影響不大，3種碳源都能正常繼代增殖，沒有顯著差異，增殖系數均達到了10以上，以蔗糖為碳源的培養基，其增殖系數以及生長狀態稍微優于另外2種碳源，因此以蔗糖為碳源最佳。

2.4??? 不同蔗糖濃度對金果欖叢生芽繼代增殖的影響

從表4可知，不同的蔗糖濃度對金果欖叢生芽的繼代增殖有明顯的影響，蔗糖濃度以25～30 g/L為宜，增殖系數分別為14.03和13.86，生長狀態也最好。蔗糖濃度過高或過低都不利于繼代增殖，濃度為15 g/L時增殖系數僅4.35，而當濃度超過30 g/L后，增殖系數也隨之降低，且長勢較差。綜合以上因素，以25 g/L的蔗糖濃度最利于金果欖叢生芽的增殖培養。

2.5??? 不同瓊脂濃度對金果欖叢生芽繼代增殖的影響

瓊脂作為凝固劑，對金果欖叢生芽的繼代增殖也有較大影響。瓊脂用量在4.0～5.0 g/L，叢生芽的增殖系數隨著瓊脂用量的加大而增加（表5），當用量升至5.0 g/L時，叢生芽的增殖系數最大，達到12.89，與其它用量相比差異顯著;而當瓊脂用量超過5 g/L時，叢生芽的增殖系數開始降低。從叢生芽苗的生長狀態來看，用量超過5 g/L對金果欖叢生芽的生長不利，當瓊脂濃度為4.5 g/L時，叢生芽的長勢最好，從總體上看，金果欖叢生芽增殖培養的瓊脂濃度以4.5～5.0 g/L為宜。

3??? 討論與結論

在植物的組織培養過程中，叢生芽的繼代增殖容易受多種因素影響，適宜的濃度水平和相互作用才能使叢生芽更好地增殖和生長[6]。課題組前期進行了金果欖組織培養技術的初步研究，總結了金果欖從初代誘導到生根移栽的基礎技術[4]，但在日常的繼代增殖過程中，發現不少因素影響著金果欖叢生芽的繼代增殖。

首先是基礎培養基類型，不同的培養基類型主要區別在于其無機鹽和離子濃度的高低不同，因此適應于不同植物的組織培養[7]。本研究中MS培養基最適合金果欖叢生芽的增殖培養，其次是N6培養基和B5培養基，效果較差的是White培養基和LS培養基。MS培養基和N6培養基都是含有較高無機鹽和較高離子濃度的培養基，說明金果欖的叢生芽增殖需要較高的無機鹽和離子濃度，其中MS培養基也是目前應用最廣的培養基[8];其次是培養基的酸堿度，不同pH下各培養基對金果欖叢生芽的增殖有顯著的影響，總體以在偏酸性的培養基中增殖效果更好，生長更旺，與藍莓[9]等的研究結果相似，常規培養基的pH控制在5.6～6.0，這一范圍對大多數植物的組織培養較為適合[10-11]，但也有偏堿性的報道[12-13]。之所以與常規培養基不同，金果欖的叢生芽更傾向于偏酸性的環境，本研究認為可能與繼代增殖過程中的分泌物有關。

增殖培養基中不同的碳源及濃度也對金果欖叢生芽分化有不同的影響，碳源為細胞的呼吸代謝提供底物與能源，在各種最簡單至最復雜的培養基中，幾乎均要加入糖作為碳源[14]，本研究中以25～30 g/L的蔗糖更適合金果欖叢生芽的增殖培養，與大多數植物組織培養的用糖量一致[11]。瓊脂作為一種培養基的凝固劑和支持物，其濃度的大小決定了培養基的硬度，影響著培養物對培養基營養成分的吸收，進而影響培養物的生長，瓊脂濃度過低則培養基不凝固，影響叢生芽接種，瓊脂濃度過高則培養基偏堿性，不適于金果欖叢生芽增殖，本研究中以4.5～5 g/L蔗糖較適合金果欖叢生芽的增殖培養，與文心蘭[15]的10 g/L、薄荷[16]的8 g/L等明顯不同，究其原因，可能與金果欖叢生芽的繼代增殖更傾向于偏酸性的環境有關，與前面的研究結果相符。

本試驗通過研究金果欖叢生芽的增殖分化過程，從培養基類型、培養基pH、不同碳源、碳源濃度以及瓊脂濃度建立了金果欖叢生芽增殖體系，為金果欖的工廠化育苗及遺傳轉化奠定基礎。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫藥科技出版社，2020：227.

[2]馮世鑫，閆志剛.中藥材金果欖生產研究現狀[J].熱帶農業科學，2021，41（6）：38-43.

[3]朱紅梅.金果欖的研究進展[J].中國民族民間醫藥雜志，2001，49：75-76.

[4]潘麗梅，馬小軍，白隆華，等.藥用植物金果欖組織培養初探[J].湖北農業科學，2015，54（5）：1 232-1 235.

[5]梁格林，劉濟明，武夢瑤，等.米槁組織培養不定芽發生與繼代增殖[J].西北植物學報，2021，41（9）：1 552-1 558.

[6]李昱瑩，郭麗麗，廉小芳，等.牡丹組織培養技術研究進展[J].浙江農業科學，2018，59（9）：1 646-1 655.

[7]王晨，張俊紅，張苗，等.柳杉優良無性系組培快繁體系研究[J].浙江農林大學學報，2020，37（4）：810-816.

[8]李俊強，林利華，張帆，等.早開堇菜組織培養及植株再生體系的建立[J].草業學報，2015，24（11）：163-173.

[9]張媛媛，朱智慧，張苗苗，等.培養基類型和植物生長物質濃度對王棗子愈傷組織誘導和繼代的影響[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2020，22（8）：2 851-2 856.

[10]趙家桔，高玲，李莉萍，等.百香果莖尖組織培養體系的建立[J].熱帶農業科學，2020，40（11）：75-80.

[11]梁格林，劉濟明，武夢瑤，等.米槁組織培養不定芽發生與繼代增殖[J].西北植物學報，2021，41（9）：1 552-1 558.

[12]劉苗苗，程智慧，溫艷斌，等.培養基和pH對大蒜莖盤不定芽誘導的影響[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2017，45（8）：129-133.

[13]喻娜.銀杏組織培養中幼莖尖外植體抗褐化培養條件的優化[J].分子植物育種，2020，18（18）：6 135-6 142.

[14]呂德任，戚華沙，黃賽，等.郁金叢生芽繼代增殖影響因素研究[J].中國園藝文摘，2017，33（5）：5-6+30.

[15]向立容，祁翔，王濟紅，文心蘭叢生芽繼代增殖關鍵技術研究[J].貴州科學，2014，32（1）：62-67.

[16]張倩，管遠清，李青.不同培養基類型對薄荷組織培養的影響[J].山東農業科學，2014，46（11）：30-31+38.