提高番木瓜組培苗生根率的培養基配方優化

成鏡 李季 戴雪梅 徐正偉 周權男 黃天帶

摘要??? 以TY-4番木瓜組培芽為試驗材料，在以半強度Murashige和Skoog培養基為基本培養基，蛭石為支撐物的基礎上，研究不同蔗糖濃度（0、5、20、40g/L）、吲哚-3-丁酸濃度（2、4、6、8 mg/L）、間苯三酚濃度（0、10.0、14.9、19.9 mg/L）對番木瓜生長狀態和生根率及根系質量的影響。結果表明：將番木瓜組培芽在含蔗糖濃度為0，吲哚-3-丁酸（IBA）濃度為2 mg/L、間苯三酚濃度為0，并補充1/2強度的MS大量元素、MS微量元素、MS有機質，肌醇0.1 g/L、硫胺素0.4 mg/L和核黃素0.38 mg/L，支撐物為蛭石的培養基中培養時，體外芽最高生根率為95.2%，與最低的生根處理相比，高出38.1%，且莖基部形成愈傷組織較少。通過正交試驗結果分析可知，番木瓜最佳的生根組合為：蔗糖濃度為0、吲哚-3-丁酸（IBA）濃度為2mg/L、間苯三酚濃度為10.0 mg/L。本研究可為番木瓜體外繁殖生根技術提供理論參考。

關鍵詞??? 番木瓜;蔗糖;吲哚-3-丁酸;間苯三酚;生根;根系質量;器官發生;蛭石

中圖分類號??? S667.9??? 文獻標識碼??? A??? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.02.010

Optimization of Rooting Medium for Tissue Culture of Papaya

CHENG Jing??? LI Ji??? DAI Xuemei??? XU Zhengwei??? ZHOU Quannan??? HUANG Tiandai

（Rubber Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，P. R. China/State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops /CATASRRI Engineering Center for Rapid Propagation of Tropical Woody Plants.，Haikou，Hainan 571101，China）

Abstract??? Tissue cultured shoots of papaya variety “TY-4”were cultured on rooting mediums with the half-strength Murashige and Skoog medium as basic medium and vermiculite as the support，supplemented with sucrose at different concentrations （0，5，20，40 g·L），indole-3-butyric acid （IBA）at 2，4，6，8 mg·L，phloroglucinol at 0，10.0，14.9，19.9 mg·L to observe the effects of the three factors，sucrose，IBA and phloroglucinol，on the growth，rooting rate and root quality. An orthogonal experiment was arranged to optimize the concentrations of the sucrose，IBA and phloroglucinol in the rooting medium. The results showed that when papaya tissue cultured shoots were cultured on the rooting medium including 1/2 strength MS with vermiculite as support，supplemented with macro-elements，trace elements，organic matter，0.1 g·L inositol，0.4 mg·L thiamine and 0.38 mg·L riboflavin at the presence of 0 sucrose，2 mg·L IBA，and 0 phloroglucinol，the rooting rate of the shoots in vitro was upto 95.2%，which was 38.1% higher than that of the treatment with the lowest rooting rate，under which less calli were formed at the base of the shoots. The orthogonal experiment showed that the optimal combination of the three factors in the papaya rooting medium is sucrose at the concentration of 0，IBA at 2 mg·L，and phloroglucinol at 10.0 mg·L.

Keywords??? papaya;sucrose;indole-3-butyric acid;phloroglucinol;rooting;root quality;organogenesis;vermiculite

番木瓜（Carica papaya L）是熱帶、亞熱帶地區廣泛栽培的多年生果樹，是國際上第四大暢銷的熱帶、亞熱帶特色水果，原產于熱帶美洲，與香蕉、菠蘿并稱“熱帶三大草本果樹”。目前，在我國的廣東、海南、廣西、云南、福建、四川等熱區已形成一定的種植規模[1-3]。

番木瓜是從種子繁殖而來的，但實際上它是一種異花授粉的物種，通過種子繁殖無法保留親代的某些特征（番木瓜植株按性別分為3種：雌株、雄株、兩性株，性別由初期的X-Y染色體控制）。研究顯示，在一個小的特定區域的Y染色體可以控制雄株（Y）或雌雄同株（Y）類型;雌株是XX類型，所有Y染色體和Y染色體都是不育的;因此，雄株和雌雄同株的類型都是雜合體（分別是XY和形式XY）。種子的繁殖還帶來果實質量、大小以及生產力的變化。而且，各種形式的木瓜果實對于生產者來說是嚴重的問題，限制了木瓜商業化。優良植物的繁殖和新品種的開發需要有效的營養繁殖技術[4]。盡管可以通過嫁接和生根插條繁殖，但由于從親本產生的植株數量有限，因此還不能滿足商業化生產需求[5]。因此，使用可繁殖大量高質量植株的微繁技術是種植該作物的迫切需求。組織培養技術可作為育種程序中重要的措施，以克服常規育種和克隆繁殖中遇到的問題。盡管用番木瓜品種成功進行組織培養已有報道，但再生枝芽的主要問題是低生根率以及基部愈傷組織的形成，阻止了根的形成，適應馴化的生根植物的比例也很低[6]。體細胞胚的發芽還經常受到高水合度和根部位愈傷組織的影響[6-7]，番木瓜的體外培養中再生植物的馴化是世界范圍內存在的最大問題。在田間種植之前，已經損失了超過70%的植株[8]。

近年來，體細胞胚發生技術已用于許多植物物種的快速繁殖。大規模繁殖的體外方案的成功取決于能否再生大量植物（低成本），并使其具有高成活率的體外條件[9-10]。然而，體細胞胚發生方案的商業化使從體外移植到離體移植后死亡或受損的植株比例很高，這仍是需要解決的問題[11]。一般而言，在半固體培養基中，通過體細胞胚發生獲得的植物，一旦產生葉子和根系，即可適應離體條件。半固體培養通常會在解剖學、生理學和形態學方面產生異常植物[10]。實際上，這些植物的特征是由葉片角質層發育不良導致的光合作用弱、與維管束系統無關的無功能的根系問題以及其他可能影響植物在適應階段生存的疾病[10-11]所引起的。

間苯三酚是生長調節劑，是木質素生物合成途徑中Phloridzin及其前體降解的產物，是一種酚類化合物，因其具有促進植物生長的特性而聞名，盡管其作用通常被其他類似化合物所掩蓋[12]。前人已證明，間苯三酚對木質化有積極作用[13-14]，減少了高水合過程[15]，并抑制從體細胞胚和胚芽獲得的芽的愈傷組織形成。周鵬等[16]將經過壯苗培養的芽接種于MS+KT （0.1～0.2）mg/L+NAA （0.05～0.1）mg/L+IBA （0.2～0.3）mg/L+蔗糖（20～30）g/L+瓊脂6.5 g/L（pH 5.6），26～28 ℃，每日光照培養12h，光照強度為1 500 lx，連續培養15～20 d進行催根培養，生根率達85%以上，該項研究的目的是使用蛭石作為支撐物，確定蔗糖、IBA、間苯三酚濃度對番木瓜芽生根的影響。本研究探討不同因素對番木瓜生長的影響大小，并篩選出適合番木瓜根系生長的最佳組合，為下一步開展番木瓜規?？旆碧峁├碚摶A。

1??? 材料與方法

1.1??? 材料

TY-4番木瓜材料經鑒定為雌雄同株，采集于三亞市林業科學研究所塑料大棚內。

1.2??? 方法

1.2.1??? 正交試驗設計??? 取生長狀況良好且帶有2～3片綠葉的芽為外植體（長1.5～2 cm），接種于含有1/2 MS大量、MS微量、MS有機、肌醇0.1 g/L，0.4 mg/L硫胺素和0.38 mg/L核黃素，不同蔗糖、吲哚-3-丁酸、間苯三酚濃度的培養基中，支撐物為蛭石;蔗糖、吲哚-3-丁酸、間苯三酚采用三因素四水平設計（表1）;培養容器為帶透氣膜的玻璃試管，pH 5.8，在溫度25℃的條件下培養30d。對照處理（PS51）：蔗糖含量0，IBA濃度2 mg/L，間苯三酚二水化合物濃度12.8 mg/L;采用L（4）正交設計表，分別設置蔗糖濃度（因素A）、IBA濃度（因素B）、間苯三酚濃度（因素C）的三因素四水平正交試驗（表2）。每個處理組合21個外植體，重復3次，接種1個月后統計生根情況：用水浸泡基質，待基質松軟后，輕輕洗掉基質，取出根系，統計生根數和觀察生根情況。

1.2.2??? 數據處理與統計分析??? 試驗數據用Excel 2003和DPS 7.05軟件進行處理和分析，用Tukey 法進行差異顯著性分析。

2??? 結果與分析

2.1??? 正交試驗設計結果分析

從表3可看出，不同培養基配方對番木瓜生根率的影響不同;其中PS35處理生根率最高，達95.2%;其次分別是PS36、PS37、PS38、PS39處理，生根率均達90.5%。雖然PS46處理的生根率也達到90%，但長出的根系短，莖基部形成大量愈傷組織，如圖1所示。PS47、PS48、PS49、PS50處理的生根率最低，分別為61.9%、57.1%、57.1%、57.1%。可以看出，蔗糖濃度為0的處理，番木瓜生根率略高于蔗糖濃度為5、20 g/L的處理，且顯著高于蔗糖濃度為40 g/L的處理。

從正交試驗結果（表3、4）的直觀分析可以看出，因素A（蔗糖濃度）對番木瓜生根率的影響較大，而因素B（IBA濃度）和因素C（間苯三酚濃度）對其影響較小。從表4的極值可確定，三因素對番木瓜生根率影響程度的主次順序為：A>B>C;根據表4中各因素水平平均值的大小，可得番木瓜生根最優組合為ABC，即蔗糖濃度0、IBA濃度2mg/L、間苯三酚濃度10.0 mg/L。

從表5可看出，3個因素對試驗結果的影響各有差異，其中因素A對本試驗結果的影響顯著，因素B和因素C對試驗結果的影響沒有達到顯著水平，說明在番木瓜生根的過程中，不同蔗糖濃度對生根率的影響最大，而IBA濃度和間苯三酚濃度對生根率影響小。

2.2??? 不同處理植株生長狀況

從圖2可以看出，蔗糖濃度為0的PS37處理，葉片呈深綠色，隨著蔗糖濃度（5～40 g/L）的升高，番木瓜黃葉情況明顯，說明生根階段低蔗糖濃度有利于番木瓜植株的健康生長。

2.3??? 不同處理根系生長情況

從圖1 可以看出，PS35、PS36、PS37、PS38、PS39處理的番木瓜根系生長較好，根截面周圍一圈都有根產生，有側根形成，莖基部無愈傷組織形成且沒有形成泡沫狀根;而PS46處理，產生的根系短，莖基部形成較多愈傷組織，植株生長狀況差，葉片變黃脫落。

3??? 討論與結論

目前，在番木瓜組織培養過程中，生根率和生根狀況一直是影響番木瓜快繁成本和田間移栽成活率的關鍵因素。然而，番木瓜高生根率和優質根系的實現，常受到諸多因素的綜合影響。

因此，篩選出適合番木瓜根系生長的最佳組合條件就顯得尤為重要。本研究通過正交試驗設計獲得了番木瓜生根的最優組合為ABC，即蔗糖濃度0、IBA濃度2 mg/L、間苯三酚濃度10.0 mg/L，與Laisyn Posada Perez 等[17]的研究結果一致。蔗糖是淀粉合成的前體物質，在植物組織培養中蔗糖是最理想的碳源之一，其作用是作為碳源和維持滲透壓;培養基中的蔗糖濃度高時會產生較高的滲透壓，使得植物組織中的水分向培養基滲透，最終導致植物組織缺水，進而影響其生長發育過程[18]。本試驗中，隨著蔗糖濃度的升高，番木瓜的黃葉數增加，這可能是由于培養基中的蔗糖濃度高，導致葉片中的水分向培養基滲透，并最終成為影響番木瓜芽生根率的主要因素。本研究得出的番木瓜生根的最優組合也可在其他作物的組培快繁體系中應用與推廣，生根階段減少使用蔗糖或者不使用蔗糖，不但能減少組培生產成本，且能減少因蔗糖而存在的污染風險。

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