采用細胞毒性試驗對23個藥用包裝材料進行生物安全性評價

黃雅理，孫會敏，林 飛，趙 霞，*，湯 龍，*

(1．中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2．海關總署國際檢驗檢疫標準與技術法規研究中心，北京 100013)

藥用包裝材料包括注射劑、輸液劑、儲血、輸血材料及其在體內長期滯留的設備或替代品的包裝等，由于藥用包裝材料絕大部分是不溶物質，可能對人體安全性危害的風險較大。其體外細胞毒性試驗如何設計，目前尚無明確的技術規范或國家標準。目前，藥用包裝材料的生物學評價多根據《國家藥包材標準》第7部分方法類藥包材標準[1]進行。但該標準只頒布了包括細胞毒性檢查法等7個生物學試驗項目，并未規定受試物前處理的詳細方法，檢測單位多參考《GB/T 16886.12-2017醫療器械生物學評價》第12部分樣品制備與參照樣品[2]的要求進行，但可變條件多、針對性不強、檢測樣品不能最大限度的進行加嚴和加速浸提，其毒理學風險性評估受到限制。

本研究參考多個國家標準(規范)對受試物前處理的要求[3-5]，針對醫療器械和包裝材料的特殊性，選擇用于注射、體內滯留等對人體風險性較高的23個包裝材料，用MEM培養液和水(氯化鈉注射液和超純去離子水)兩種前處理方法，制備檢測樣品浸提液作為溶劑，配制加胎牛血清的完全培養液，經與培養細胞接觸之后，確認各檢測樣品浸提液是否能引起細胞毒性反應。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 檢測樣品藥用包裝材料來自16個企業共23個樣品，詳見表1。將圓粒樣品和橡膠樣品剪切成≤25 mm×10 mm×5 mm；薄膜樣品裁剪成25 mm×5 mm；如樣品規格≤上述體積，不做剪切。用常溫去離子水在2號標準篩中清洗2遍，置50℃恒溫干燥箱中烘干備用。

1.1.2 培養基MEM干粉培養基，每袋93.9 g，購于美國Gibco公司。

1.1.3 浸提介質氯化鈉注射液，由石家莊四藥股份有限公司生產；自制超純去離子水和MEM培養液。

1.1.4 對照品細胞毒性陰性對照品為高密度聚乙烯膜(面積25 mm×5 mm)，由中國食品藥品檢定研究院提供。陽性對照品為二甲基亞砜(DMSO)，分析純，由天津市福晨化學試劑廠生產。

1.1.5 細胞株小鼠成纖維細胞L929，由中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所提供。

1.1.6 儀器及其他本研究使用的主要儀器和實驗物品包括：CO2培養箱，倒置顯微鏡，酶標儀，分度值(d)0.001 g的電子天平，超純水制備系統，pH計，滲透壓分析儀；2G砂芯抽濾漏斗，0.22μm濾膜除菌器，96孔培養板，25 mL細胞培養瓶等。

1.1.7 實驗室環境在100級潔凈度的超凈工作臺中操作。室溫20～25℃，相對濕度40%～70%。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養小鼠成纖維細胞L929采用含10%胎牛血清的MEM培養液(完全培養液)，置于CO2培養箱中37℃條件下培養48～72 h，取生長旺盛的細胞用于當天試驗[6]。

1.2.2 檢測樣品培養基浸提液制備分別稱取5.0 g高壓滅菌后的檢測樣品，按0.2 g/mL計算浸提液體積，加入無血清MEM培養液至25 mL。經37℃振蕩浸提24 h，其浸提液用2G砂芯抽濾漏斗濾除浸提液粗沉淀物和檢測樣品后，加10%胎牛血清，經0.22 μm濾膜除菌器濾除細菌后用于試驗[2]。

1.2.3 檢測樣品水浸提液制備分別稱取5.0 g檢測樣品，按0.2 g/mL計算浸提液體積，加氯化鈉注射液或超純去離子水至25 mL。在高壓滅菌鍋中121℃(壓力0.105 MPa)下浸提1 h，其浸提液用2G砂芯抽濾漏斗濾除浸提液粗沉淀物和檢測樣品后，作為溶劑配制MEM培養基，加10%胎牛血清，經0.22μm濾膜除菌器濾除細菌后用于試驗[2，7]。

1.2.4 實驗分組空白對照組為不加任何物質的完全培養液。陰性對照組為高密度聚乙烯膜按3 cm2/mL制備的水浸提液(方法同1.2.3)。陽性對照組是在完全培養液中加入10%的DMSO。試驗組分為MEM培養基浸提液、氯化鈉注射液浸提液和超純去離子水浸提液。

1.2.5 檢測浸提液制備條件對細胞毒性反應的影響選擇2個細胞毒性反應為4級的氯化鈉注射液浸提液檢測樣品，改變浸提溫度和時間，制備121℃、20 min，121℃、30 min，121℃、1 h，70℃、24 h，50℃、72 h共5個條件下的浸提液，比較細胞毒性反應大小。

1.2.6 滲透壓和p H值的測定為了解不同條件下制備的浸提液滲透壓和PH值變化，制備121℃、20 min，121℃、30 min，121℃、1 h，70℃、24 h，50℃、72 h共5個條件下的氯化鈉注射液和超純去離子水浸提液，用滲透壓分析儀和pH計測定濃度和pH值，確定數值變化范圍[5]。

1.2.7 細胞毒性試驗用完全培養液將L929細胞配制成濃度為1×104個/mL的細胞懸液接種于4個96孔培養板，每孔接種100μL。置于CO2培養箱(CO2體積分數為5%)37℃靜置培養24 h，細胞貼壁生長后，棄除每孔中的上層液體。設空白對照、陰性對照、陽性對照、23個MEM培養基浸提液處理組和23個氯化鈉注射液浸提液處理組，每組各設6孔，每孔加入100μL完全培養液或由浸提液配制的完全培養液，置于CO2培養箱繼續靜置培養。

細胞接觸檢測樣品48 h，取出96孔培養板，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。每孔加入20μL質量濃度為0.5%的MTT溶液，混合均勻后，繼續培養4 h，棄除每孔中的上層液體。加入150μL DMSO，于振蕩器上振蕩10 min，用酶標儀在570和630 nm波長下測定吸光度值。

1.2.8 統計學分析用各試驗組(包括陰性對照、陽性對照)和空白對照組測出的吸光度平均值計算細胞相對增殖率(relative growth rate，RGR)不進行組間數值差異性分析。

1.2.9 結果判定與評價細胞毒性反應分級標準[6]按：RGR≥100%為0級；RGR在80%(含)～100%為1級；RGR在50%(含)～80%為2級；RGR在30%(含)～50%為3級；RGR在0(含)～30%為4級。≤1級為陰性，2級為可疑陽性，≥3級為陽性。空白對照組細胞生長良好，陰性對照組的RGR＞80%，陽性對照組的RGR＜30%，本次試驗結果成立。如果RGR不在此范圍，則應重新進行試驗。

2 結果

2.1 3種浸提液的細胞毒性試驗結果

陰性對照組的RGR＞91%，細胞毒性反應為0～1級；陽性對照組的RGR＜16%，細胞毒性反應均為4級。檢測樣品MEM培養基浸提液的RGR為86%～109%，細胞毒性反應為0～1級；檢測樣品氯化鈉注射液浸提液的RGR為6%～92%，細胞毒性反應為1～4級；其中氯化鈉注射液浸提液≥2級的9個檢測樣品用超純去離子水浸提液復試其RGR為45%～105%，細胞毒性反應為1～3級。見表2。

2.2 改變浸提溫度和時間對細胞毒性試驗的影響

氯化鈉注射液浸提液細胞毒性反應為4級的2個檢測樣品，在低于121℃、30 min條件的浸提液，其RGR為72%～94%，細胞毒性反應為1～2級；而121℃、60 min浸提液RGR為15%～40%，細胞毒性反應為3～4級。見表3。

表3 氯化鈉注射液不同浸提條件對細胞毒性試驗的影響

2.3 改變浸提條件對浸提液滲透壓和p H值的影響

隨著溫度和時間的增加，浸提液的滲透壓有一定升高。在121℃、60 min條件下，氯化鈉注射液浸提液配制的培養液溶出值最高為534.00 mol/L，超純去離子水浸提液配制的培養液次之為352.33 mol/L；用兩種浸提介質配制的完全培養液其濃度相差181.67 mol/L。其滲透壓數值增加對表2試驗結果存在一定影響，而上述條件的改變對pH值影響不大，其范圍在0.25～0.37之間波動。見表4、5。

表2 3種浸提液的細胞毒性試驗結果

表4 雙向拉伸聚酯薄膜不同浸提條件對滲透壓的影響

3 討論

小鼠成纖維細胞L929的細胞毒性試驗是一種體外檢測方法，與體內試驗方法相比具有簡便、快速、重復性好、干擾少、敏感性高、可避免倫理問題等優點[7]，已納入國內、外生物材料臨床前常規檢測項目，在評價生物安全性方面發揮著重要作用。

隨著現代細胞生物學與分子生物學技術的不斷發展，新材料的不斷涌現[8]，用于臨床的藥用包裝材料的風險性在提高[9]。由于絕大多數藥用包裝材料不易溶解，用前處理方法制備浸提液，在相關標準中均未明確說明。實際工作中，同樣材料進行的細胞毒性試驗，由于前處理方法不得當[10]，很可能出現不同的試驗結果。所用浸提介質和浸提條件應結合受試樣品的特性和臨床應用情況，在不改變材料物理和化學性能同時，在標準規定范圍，使用能溶出物質更多的高濃度、高溫度、長時間、攪拌等加嚴和加速浸提條件[2]，能準確評估受試樣品的風險。

表5 雙向拉伸聚酯薄膜不同浸提條件對p H值的影響＊

體外細胞毒性試驗受外界因素影響較大，樣品浸提方式及浸提介質的合理性，浸提液中浸提物質粒子大小、數量、pH值、滲透壓、無菌性、穩定性、儲存時間和溫度的變化等存在多項不確定性，建議上述理化指標經預試驗滿足基本要求[11]后，再開始進行正式試驗。

在本實驗室條件下，小鼠成纖維細胞對23個原料樣品用氯化鈉注射液作為浸提介質在121℃、60 min浸提后進行檢測，發現細胞毒性反應1級的14個；2級的6個；3級的1個；4級的2個。顯示藥品包裝材料通過體外細胞毒性試驗，能夠發現存在毒性反應的受試樣品。

用培養基浸提液作為浸提介質經37℃、24 h浸提后進行檢測，發現細胞毒性反應全部是0級和1級；50℃和70℃所制備出的浸提液雖然延長了浸提時間，但溶出物質仍然有限，對濃度、滲透壓比值、pH值等影響很小。證實該浸提條件不能最大限度的浸提出受試樣品中的物質，容易漏判可檢出陽性的醫用材料，如不是對高溫有影響的受試樣品建議不作為首選。

用超純去離子水作為浸提介質在121℃、60 min浸提后進行細胞毒性檢測，是對溶出度較高、滲透壓值增加，對試驗結果存在一定影響的補充試驗，前期需經過對濃度、滲透壓比值、pH值以及粒子數量、大小等檢測，如能符合試驗要求，其結果能排除外來因素的影響，較準確發現存在毒性反應的物質。

綜合以上結果，本實驗在不改變檢測樣品物理和化學性能同時，使用最大可溶出物質的檢測樣品浸提液作為溶劑配制MEM培養基，發現3個檢測樣品的細胞毒性反應結果陽性。因此，臨床如在高溫、高濕、高壓下滅菌使用這些樣品，須進行毒理學安全性風險評估。