鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方的遺傳毒性評(píng)價(jià)

侍雯婧，張吉芊竹，#，朱江波，張曉芳，王瑞娜，戴小宇，任麗君，田逸君，*

(1．海軍軍醫(yī)大學(xué)衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，上海 200433；2．海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，上海 200433)

暈動(dòng)病(motion sickness)，也稱為運(yùn)動(dòng)病，即指人們?nèi)粘Ｕf(shuō)的“暈車、暈船、暈機(jī)”等，是由多種因素導(dǎo)致人體對(duì)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)錯(cuò)誤感知的一系列生理反應(yīng)。常見(jiàn)于乘坐交通工具時(shí)，癥狀主要有頭暈、惡心、嘔吐、上腹部不適、面色蒼白、出冷汗等，嚴(yán)重的可能會(huì)導(dǎo)致冷漠、抑郁，甚至導(dǎo)致認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)能力下降[1-2]。該病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未形成統(tǒng)一的診治規(guī)范，仍以藥物治療為主[3]。相關(guān)研究表明苯海拉明對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，可產(chǎn)生鎮(zhèn)靜和嗜睡等抑制作用，從而快速改善眩暈發(fā)作[4]。咖啡因是一種存在于各種植物中的天然生物堿，是消費(fèi)最廣泛的興奮劑之一。這兩種藥物對(duì)處于抑制狀態(tài)的中樞神經(jīng)尤其有效，對(duì)心血管系統(tǒng)具有正性作用，還能促進(jìn)胃酸分泌及治療偏頭痛等疾病，并在機(jī)體的多個(gè)系統(tǒng)中發(fā)揮廣泛的作用[5]。Crawford等[6]通過(guò)系統(tǒng)回顧有關(guān)含咖啡因的食品和飲料對(duì)健康成年人大腦認(rèn)知功能影響的研究發(fā)現(xiàn)，咖啡因補(bǔ)充劑能夠改善睡眠不足者的認(rèn)知功能，如提高注意力和警惕性，縮短對(duì)復(fù)雜情況的反應(yīng)時(shí)間以及提升解決問(wèn)題和推理問(wèn)題的能力。考慮到苯海拉明抗暈動(dòng)癥的同時(shí)有中樞抑制的副作用。藥物組成復(fù)方一直是臨床上用于增強(qiáng)藥物療效、降低藥物不良反應(yīng)的常用方式。因此通過(guò)將苯海拉明與咖啡因組成復(fù)方，在發(fā)揮苯海拉明抗暈動(dòng)癥作用的同時(shí)，利用咖啡因降低嗜睡反應(yīng)的發(fā)生率。迄今為止，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有關(guān)鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方安全性評(píng)價(jià)方面的研究報(bào)道。為提高臨床用藥的安全性，本試驗(yàn)采用Ames試驗(yàn)、體外培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞(Chinese hamster lung cells，CHL)染色體畸變?cè)囼?yàn)和ICR小鼠骨髓微核試驗(yàn)對(duì)鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方進(jìn)行了遺傳毒性檢測(cè)，為鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方的臨床合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方鹽酸苯海拉明為N，N-二甲基-2-(二苯基甲氧基)乙胺鹽酸鹽(500 g/袋，批號(hào)DH-201812104)，由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系提供，白色結(jié)晶性粉末，無(wú)臭，干燥、陰涼保存，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。咖啡因?yàn)?,3,7-三甲基-3,7-二氫-1H-嘌呤-2,6-二酮一水合物或其無(wú)水物(1 000 g/袋，含量為99.8%，批號(hào)16112112)，由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系提供，白色有絲光的針狀結(jié)晶，無(wú)臭，室溫、干燥、密封保存，分子結(jié)構(gòu)式如圖2。經(jīng)前期文獻(xiàn)[7]調(diào)研，分別查閱了苯海拉明和咖啡因單獨(dú)應(yīng)用的安全性相關(guān)文獻(xiàn)[8-14]。苯海拉明和咖啡因在臨床常用劑量(苯海拉明12.5～25 mg，咖啡因50～200 mg)下安全。依據(jù)小鼠和大鼠藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定苯海拉明咖啡因復(fù)方的藥物組成為苯海拉明∶咖啡因=25 mg∶60 mg。藥效學(xué)研究的多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該配比組成在發(fā)揮苯海拉明抗暈動(dòng)癥作用的同時(shí)，咖啡因降低了嗜睡反應(yīng)的發(fā)生率，效果比較理想。

圖1 鹽酸苯海拉明結(jié)構(gòu)式[15]1 000

圖2 咖啡因結(jié)構(gòu)式[15]649

1.1.2 CHL細(xì)胞及大鼠肝微粒體酶S9CHL細(xì)胞購(gòu)自于上海中喬新舟生物科技有限公司。S9購(gòu)自美國(guó)Moltox公司，批號(hào)4144；規(guī)格2 mL/支；有效期至2021年12月12日；-80℃保存。代謝活化系統(tǒng)是S9和輔助因子的混合物，臨用前新鮮配制。

1.1.3 動(dòng)物SPF級(jí)ICR小鼠共60只，每組10只，雌雄各半，5～7周齡，雌鼠體質(zhì)量21.7～25.1 g；雄鼠體質(zhì)量23.5～26.8 g，源自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)2018006019883。

1.2 試驗(yàn)方法

按最新的《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[16-17]的設(shè)計(jì)要求，分別應(yīng)用Ames試驗(yàn)[18]、體外培養(yǎng)CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)[19]和ICR小鼠骨髓微核試驗(yàn)[20]檢測(cè)鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方的遺傳毒性。檢測(cè)終點(diǎn)覆蓋了基因突變和染色體損傷。

1.2.1 Ames試驗(yàn)組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535共5個(gè)菌株，均購(gòu)自美國(guó)Moltox公司。所用菌株均已進(jìn)行了R因子、組氨酸缺陷型等鑒定，結(jié)果表明本試驗(yàn)所用的各種菌株基因型均合格。Ames試驗(yàn)受試物的最高濃度主要取決于受試物對(duì)細(xì)菌的毒性和溶解度。對(duì)不受溶解度或細(xì)胞毒性限制的受試物，應(yīng)達(dá)到的最高濃度為5 mg/皿[9]，故設(shè)鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方總劑量為0.5、5、50、500、5 000 mg/皿共5個(gè)劑量組，此外設(shè)空白對(duì)照、溶媒對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照組(見(jiàn)表1)，每皿均加入相應(yīng)濃度的供試品溶液0.1 mL。采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法，使細(xì)菌在加和不加S9(大鼠肝微粒體酶S9勻漿4 mL、0.2 mol/L pH=7.4的PBS 50 mL、MgCl2-KCl溶液2.0 mL、1 mol/L 6-磷酸葡萄糖溶液0.5 mL、0.1 mol/L NADP/輔酶Ⅱ4.0 mL、無(wú)菌去離水17.5 mL)的條件下接觸受試物，每皿均加入供試品、溶媒對(duì)照(超純水)或陽(yáng)性對(duì)照物0.1 mL，加S9組在每個(gè)平皿的試驗(yàn)體系中加入0.5 mL的S9混合液，不加S9組在每個(gè)平皿的試驗(yàn)體系中加入0.5 mL的PBS。每個(gè)劑量組及對(duì)照組均平行設(shè)3個(gè)皿。采用最低極限(能使組氨酸缺陷型菌株長(zhǎng)成菌落所需的最小濃度的組氨酸瓊脂平板)的組氨酸瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，先用顯微鏡觀察平皿上的菌苔生長(zhǎng)情況，確定受試物無(wú)明顯的抑菌或殺菌作用，再人工計(jì)數(shù)每皿回復(fù)突變的菌落數(shù)，并計(jì)算每組的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，與溶劑對(duì)照組進(jìn)行比較。

表1 Ames試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照品及其濃度(100μL/皿)

1.2.2 體外培養(yǎng)CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)染色體畸變預(yù)試驗(yàn)最高濃度為0.5 mg/mL，溶解受限時(shí)，以受試物在溶媒中的最大溶解度為最高濃度，再按等比級(jí)數(shù)設(shè)計(jì)若干個(gè)濃度[9]。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)測(cè)定供試品鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方的IC50。本次預(yù)試驗(yàn)結(jié)果IC50為33.8 mg/mL。故在加和不加S9(S92.0 mL、HEPES 6.3 mg、MgCl2·6H2O 6.9 mg、KCl 16.4 mg、6-磷酸葡萄糖10.1 mg、70%NADP 27.3 mg、無(wú)菌去離子水4.6 mL)的條件下，體外培養(yǎng)的CHL細(xì)胞中加入相應(yīng)濃度的低(8.45 mg/mL)、中(16.9 mg/mL)、高(33.8 mg/mL)劑量組供試品，反應(yīng)體系總體積為6 mL。另設(shè)溶媒對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組均設(shè)2個(gè)平行樣品。陽(yáng)性對(duì)照：-S9時(shí)用0.5 mg/mL絲裂霉素C，+S9時(shí)用60 mg/mL環(huán)磷酰胺。藥物作用分別于細(xì)胞4 h后棄去原培養(yǎng)基加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，或作用于細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞。終止培養(yǎng)前4 h，加入20 mg/mL秋水仙堿60 mL，培養(yǎng)結(jié)束收集細(xì)胞，經(jīng)離心、低滲處理后，再進(jìn)行固定、離心、制片得細(xì)胞染色體玻片，鏡檢前用劉氏染液染色，每個(gè)劑量組制備2～4張玻片標(biāo)本。

鏡檢時(shí)每組觀察300個(gè)分散良好并且數(shù)目完整的中期分裂相細(xì)胞染色體(若觀察到大量畸變?nèi)旧w，如陽(yáng)性對(duì)照組，分析染色體數(shù)可相應(yīng)減少為100個(gè))。分別記錄各組含有結(jié)構(gòu)畸變?nèi)旧w的細(xì)胞數(shù)和畸變類型(計(jì)數(shù)染色體或染色單體的斷裂、缺失及其他類型結(jié)構(gòu)異常的數(shù)目)，裂隙單獨(dú)記錄，但不計(jì)入畸變率中。同時(shí)單獨(dú)記錄多倍體和核內(nèi)復(fù)制等數(shù)目畸變，均不計(jì)入畸變率中。計(jì)算每組的染色體畸變率。

1.2.3 ICR小鼠骨髓微核試驗(yàn)檢疫期結(jié)束后對(duì)小鼠稱量體質(zhì)量并按隨機(jī)區(qū)組法分成6組，根據(jù)ICR小鼠單次給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果，供試品鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方LD50為172.7 mg/kg。本次試驗(yàn)以1/2 LD50為最高劑量，其他劑量按等比級(jí)數(shù)設(shè)置，分別為上一個(gè)劑量的1/2[9]。故 設(shè) 低(21.59 mg/kg)、中(43.17 mg/kg)、高(86.35 mg/kg)劑量組小鼠經(jīng)口灌胃，其中高劑量組設(shè)兩組，分別在藥物作用24 h和48 h后處死，并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(40 mg/kg環(huán)磷酰胺腹腔一次注射，給藥容量為10 mL/kg)和溶劑對(duì)照組(經(jīng)口灌胃超純水)，給藥容積為15 mL/kg。除高劑量48 h組外，其他組均在藥物作用24 h后處死。取股骨制備骨髓涂片，每只小鼠制2張骨髓片，自然干燥后，取劉氏染液A液和B液，按2∶1混勻配制成應(yīng)用液，均勻鋪于玻片表面，染色1～2 min后用清水沖洗掉玻片上的染色液，自然晾干。

每只動(dòng)物鏡檢約4 000個(gè)骨髓嗜多染紅細(xì)胞(polychromatic erythrocytes，PCE)，計(jì)數(shù)含微核的PCE數(shù)，計(jì)算微核發(fā)生率，同時(shí)至少計(jì)數(shù)500個(gè)骨髓紅細(xì)胞以確定嗜多染紅細(xì)胞(PCE)與正染紅細(xì)胞(normochromatic erythrocytes，NCE)的比例，評(píng)價(jià)受試物是否有骨髓毒性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

Ames試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)是以比較給藥組與溶劑對(duì)照組的回復(fù)突變菌落數(shù)為基礎(chǔ)，若某劑量組回復(fù)突變菌落數(shù)為溶劑對(duì)照組的2倍以上，呈現(xiàn)可重復(fù)性，并在一定的劑量范圍內(nèi)存在著劑量-反應(yīng)關(guān)系，則判斷為陽(yáng)性[11]；CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)和ICR小鼠骨髓微核試驗(yàn)均采用卡方檢驗(yàn)比較給藥組與溶媒對(duì)照組之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[12-13]。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Ames試驗(yàn)結(jié)果

所有平皿經(jīng)觀察均未見(jiàn)雜菌污染，并可見(jiàn)背景目標(biāo)菌苔生長(zhǎng)。5個(gè)菌株的自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)以及陽(yáng)性對(duì)照誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)均在歷史對(duì)照范圍內(nèi)，并且陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比回復(fù)突變菌落數(shù)顯著增加，提示本試驗(yàn)系統(tǒng)符合試驗(yàn)要求。在受試物最高劑量達(dá)到5 000 mg/皿的受試條件下，未觀察到鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方的抑菌現(xiàn)象。各劑量組受試物在加和不加S9時(shí)物種菌株所誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)均與自發(fā)的突變菌落數(shù)相近，并且未觀察到明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方的Ames試驗(yàn)回變菌落數(shù)(個(gè)/皿，±s)

表2 鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方的Ames試驗(yàn)回變菌落數(shù)(個(gè)/皿，±s)

組別受試物0.5 mg/皿5 mg/皿50 mg/皿500 mg/皿5 000 mg/皿空白對(duì)照組溶劑對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組TA97+S9 59±1 53±8 69±3 65±9 69±13 63±23 63±12 680±72-S9 64±6 57±3 58±7 60±5 59±11 60±9 56±6 630±48 TA98+S9 17±2 17±2 16±2 29±7 25±6 23±3 23±6 847±46-S9 16±2 14±2 18±2 23±4 26±3 25±9 19±3 1 019±162 TA100+S9 98±2 129±22 116±28 104±17 110±19 118±33 113±15 785±224-S9 93±13 107±3 113±12 94±24 115±12 119±9 115±17 854±54 TA102+S9 147±12 173±58 163±57 183±53 178±46 171±20 179±32 1 028±82-S9 172±41 190±56 194±23 159±37 179±22 171±36 197±28 970±32 TA1535+S9 17±2 12±4 11±2 9±3 12±4 18±1 21±5 453±30-S9 17±1 14±4 10±4 10±2 12±4 12±3 16±4 452±22

2.2 體外培養(yǎng)CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果

見(jiàn)表3。經(jīng)顯微鏡觀察陽(yáng)性對(duì)照組能夠誘發(fā)受試細(xì)胞染色體的畸變率顯著增高，與溶劑對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方各劑量組的CHL細(xì)胞染色體畸變率與溶劑對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果為陰性。

表3 鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方的體外培養(yǎng)CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果

2.3 ICR小鼠骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果

見(jiàn)表4。鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方各劑量組小鼠在給藥后未見(jiàn)異常，且未出現(xiàn)動(dòng)物死亡。鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方不同劑量下雌、雄小鼠骨髓細(xì)胞中PCE/(PCE+NCE)＞50%，未觀察到對(duì)小鼠骨髓的抑制作用，各劑量組微核率與溶劑對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方小鼠骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

表4 鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方的ICR小鼠骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

3 討論

本研究采用的是遺傳毒性研究經(jīng)典的試驗(yàn)組合，這3個(gè)試驗(yàn)分別從體外到體內(nèi)，從微生物、離體細(xì)胞和整體動(dòng)物水平上評(píng)價(jià)藥物的遺傳毒性，是最新的《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》推薦的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合[16-17]，體外試驗(yàn)中包含了加與不加代謝活化系統(tǒng)，能檢測(cè)基因突變、染色體畸變等多個(gè)遺傳學(xué)終點(diǎn)，符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的要求。隨著新型藥物的涌現(xiàn)以及對(duì)藥物評(píng)價(jià)試驗(yàn)要求的不斷提高，傳統(tǒng)的試驗(yàn)體系也歷經(jīng)了一系列優(yōu)化[21]。近幾年受到普遍關(guān)注的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體外微核[22]、彗星試驗(yàn)[23-24]，Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)[25]，作為逐漸被認(rèn)可的遺傳試驗(yàn)方法，讓今后的遺傳毒性測(cè)試方法組合增加了更多選擇，使遺傳毒性評(píng)價(jià)體系更加完善。

我們分別查閱了苯海拉明和咖啡因遺傳毒性相關(guān)的文獻(xiàn)。苯海拉明和氫氯噻嗪對(duì)TA98菌株有致突變作用[26]；鹽酸苯海拉明在濃度達(dá)150或50 kg/mL時(shí)，未觀察到細(xì)胞周期的延遲，無(wú)論是否加入S9，均未誘發(fā)染色體畸變。在高劑量(300 pg/mL)下，加S9組的染色體畸變?cè)囼?yàn)在標(biāo)準(zhǔn)收獲期為陰性，但計(jì)數(shù)少于100個(gè)中期細(xì)胞可被忽略。在最高劑量(含和不含S9)下，在一個(gè)18 h的實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)生染色單體斷裂、三輻體和四輻體；在一個(gè)16 h的化學(xué)暴露和6 h的恢復(fù)期的實(shí)驗(yàn)中，X染色體上一個(gè)位點(diǎn)的染色體斷裂數(shù)對(duì)陽(yáng)性反應(yīng)有顯著影響[27]。苯海拉明急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)口小鼠LD50為160 mg/kg；腹腔內(nèi)注射小鼠LD50為56 mg/kg；靜脈注射小鼠LD50為20 mg/kg[28]。與此同時(shí)，有報(bào)道咖啡因急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)口給藥時(shí)對(duì)小鼠、倉(cāng)鼠、大鼠、兔的LD50分別為127、230、355、246 mg/kg(雄性)和137、249、247、224 mg/kg(雌性)[28]。咖啡因的致突變潛力已在低等生物中得到證實(shí)，大多數(shù)關(guān)于其誘導(dǎo)染色體損傷的數(shù)據(jù)是在濃度約為咖啡過(guò)量者預(yù)期劑量6～100倍的情況下獲得的，并且通常比咖啡因?qū)θ梭w的估計(jì)致死劑量大幾個(gè)數(shù)量級(jí)[29]。因此，飲用適量到正常量的咖啡和咖啡因誘發(fā)人類突變效應(yīng)的可能性幾乎是不存在的。有研究表明咖啡因及其衍生物和代謝物可在輻射引起的多種細(xì)胞和組織損傷中發(fā)揮抗氧化、化學(xué)預(yù)防和輻射防護(hù)作用，對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)的癌變產(chǎn)生保護(hù)作用[30]。本次評(píng)價(jià)的藥物是一類復(fù)方制劑，主要利用咖啡因興奮作用與苯海拉明鎮(zhèn)定作用的互補(bǔ)，以彌補(bǔ)苯海拉明因嗜睡產(chǎn)生的不適感覺(jué)。將這兩種藥物以一定比例混合而得的復(fù)方制劑屬國(guó)內(nèi)首創(chuàng)，且該類復(fù)方制劑的遺傳毒性研究此前未見(jiàn)報(bào)道。綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)條件下鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方制劑的毒性小于單一樣品。本研究結(jié)果提示鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方不具有遺傳毒性和潛在致癌性，與相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論基本相符，本次研究對(duì)于其將來(lái)的應(yīng)用及推廣具有參考意義。