人乳頭瘤病毒相關的口咽鱗狀細胞癌分子病理診斷新進展

楊 欣，郭會芹

(國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院病理科，北京 100021)

口咽癌(oropharyngeal cancer，OPC)是我國常見的頭頸部惡性腫瘤之一，主要來源于舌根、扁桃體、軟腭和咽后壁等部位，病理類型多為鱗狀細胞癌，男性多發。2015年中國癌癥統計顯示唇癌、口腔癌及口咽癌、喉咽癌的總發病率為48.1/10萬，死亡率為22.1/10萬[1]。中國OPC在2008—2012年間每年發病率約為3.28/10萬(男性4.26/10萬，女性2.26/10萬)，占所有癌癥新發病例的1.16%，位列第20位[2]。世界范圍內18%～72%口咽鱗狀細胞癌(oropharyngeal squamous cell carcinoma，OPSCC)的發生與高危HPV感染有關[3]，其中HPV16、18為兩種主要致癌病毒[4]。國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)提出HPV相關OPSCC的發生率與地域有關，南歐發生率小于20%，北美發生率大于60%[5]，而亞洲發生率為17%[6]。中國不同地區HPV相關OPSCC的發生比例各異，數據顯示中國華南、華東和東北地區的陽性率分別為20.8%、11.7%和5.51%[7-9]。WHO頭頸部腫瘤分類2017版基于HPV感染狀態，將OPSCC分為HPV陽性及HPV陰性兩個組織學類型[10]，HPV陽性的OPSCC有其獨特的生物學行為和較好的臨床預后。HPV狀態判斷的方法有常規HE染色下形態學評估、p16免疫組織化學染色和HPV病毒特異性檢測。

1 HPV相關口咽癌的病理形態學特征

WHO頭頸部腫瘤分類2017版指出：HPV陽性的OPSCC多數呈非角化形態，腫瘤起源于腺窩上皮，形成大而堅實且邊緣光滑的巢狀或者小葉狀細胞團，中央可伴有壞死；腫瘤細胞胞質少，細胞邊界不清，細胞核深染，呈橢圓形至梭形，核質比大，有絲分裂活性及凋亡活性較高，往往呈基底樣形態，伴有豐富的淋巴細胞浸潤[10]。HPV陰性的OPSCC多數呈角化形態，因具有豐富且成熟的細胞質，獨特的細胞邊界和細胞間橋的多邊形細胞組成，其生長模式通常是浸潤性的，呈角狀的腫瘤巢具有錐形延伸和明顯的間質結締組織增生，所以HPV陰性的OPSCC比HPV陽性的OPSCC更容易發生淋巴結轉移[11]。但是，形態學判斷并不完全準確，例如認為所有伴角化的鱗狀細胞癌均與HPV無關是不正確的，因為一小部分HPV陽性的OPSCC也可表現出與常規鱗狀細胞癌相同的角化，尤其既往接受過治療的病例，角化可能更明顯[12]。盡管經典型HPV陽性的OPSCC呈低分化形態，缺乏角化或者往往角化不顯著，伴大量有絲分裂，但是患者預后良好，其分子機制需進一步研究。HPV陽性OPSCC表達常規鱗狀上皮標記物，如p40、p63和CK5/6，p53往往呈野生型，未出現突變。

2 p16免疫組織化學染色

p16蛋白是一種細胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑，在持續性HPV感染中由于E7蛋白降解視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)而出現過表達，p16免疫組織化學染色(immuno-histochemistry，IHC)被證明是OPSCC一種敏感的HPV感染狀態的替代檢測方法。美國病理學家協會(College of American Pathologists，CAP)發布了頭頸癌HPV病毒檢測指南，建議使用p16 IHC作為腫瘤HPV感染狀態檢測的替代方法[13]。該方法可應用于組織標本或細胞蠟塊，操作簡單且費用低，是臨床上應用最廣的檢測方法。p16 IHC顯示細胞質和細胞核彌漫性表達，當70%以上的腫瘤細胞呈現中等到強的彌漫的細胞質和細胞核著色時，HPV結果判讀為陽性。研究[14]提示，50%～70%腫瘤細胞著色的病例需要增加HPV病毒檢測進一步確定是否存在HPV感染。當用淋巴結細針穿刺標本的細胞塊進行p16免疫組化時，CAP建議判讀標準中著色腫瘤細胞的數量可以減少10%～15%，因為淋巴結轉移往往因發生囊性變而導致腫瘤細胞出現明顯的退變和壞死[13]。

理論上，p16過表達由病毒E7蛋白降解Rb蛋白所致，與感染病毒的亞型無關，也就是說各種亞型的病毒感染均能反映在p16蛋白上，因此其敏感性較高，接近100%，但其特異性存在質疑[15-17]。研究顯示，p16彌漫強陽性還可見于包括皮膚鱗狀細胞癌、腺樣囊性癌、神經內分泌癌和黑色素瘤等多種腫瘤，此時p16過表達可能與Rb基因突變所致的功能失調有關，而與HPV感染無關[12]。Nauta等[18]分析了一組口咽癌中p16+/HPV DNA-患者的預后，發現與p16和HPV DNA均陽性患者相比，該亞組5年總生存率明顯較差，接近p16-/HPV-組，進一步說明p16 IHC檢測存在假陽性判讀的情況。因此，臨床現行的p16 IHC作為HPV風險分層的獨立檢測方法存在診斷風險，OPSCC的精準診療中需要更可靠且可行的HPV病毒特異性檢測。

3 HPV病毒特異性檢測方法

3.1 原位雜交檢測HPV DNA

原位雜交的方法是基于基因層面，利用其復制、轉錄的特點，將帶有特定標記的已知序列核酸探針與待測細胞或者組織中提取的核酸進行雜交，從而定位有HPV感染的細胞或者組織，并可對其進行定量定性分析。DNA原位雜交(in situhybridization，ISH)是臨床上較為常見的分子檢測技術，在OPSCC的HPV檢測當中也是經常被納入二線參考的方法。臨床上DNA ISH檢測既可以使用組織標本，也可以使用細胞標本，可以檢測多種HPV亞型。其最大的優點是使腫瘤細胞內的靶DNA可以在細胞及組織切片上呈可視化，從而確保基因檢測的準確性[19]。目前，關于DNA ISH檢測方法的敏感性及特異性的數據較少，Qureishi等[20]的研究顯示，DNA ISH與p16 IHC相比，具有較高的特異性(88%和82%)及較低的敏感性(88%和94%)，尤其是當腫瘤組織中的HPV DNA拷貝數較低時檢測敏感性會進一步降低。

3.2 PCR檢測HPV DNA

PCR是體外酶促合成特異性DNA片段的一種方法，通過特定引物介導目標DNA(E6/E7)的擴增，以此檢測HPV感染狀態。有實驗將107例HPV陽性標本提取的DNA分別用GP、SP16/SP18、SP16b 3組引物進行擴增，結果證明以GP作為共同引物檢出率較高[21]。新鮮冷凍樣本及福爾馬林固定石蠟包埋樣本(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)均可進行HPV DNA PCR檢測[22]，PCR克隆DNA具有操作簡便、省時的優點。文獻報道，以p16 IHC為對照，DNA PCR檢測HPV感染狀態的敏感性及特異性分別為97%和87%[20]。DNA PCR與DNA ISH相比較，兩者敏感性相似，但是前者的特異性低于后者[23]。有研究發現通過ddPCR(droplet-based digital PCR)檢測血液循環腫瘤DNA(ctDNA)中的HPV病毒表達情況，可作為一種有用且無創的檢測方法。通過對治療前的OPSCC血液進行HPV16 ctDNA檢測發現，ddPCR評估的HPV16 ctDNA拷貝數與腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移，以及臨床分期顯著相關[24]。

3.3 原位雜交檢測HPV RNA

HPV E6/E7 mRNA是CAP推薦的金標準檢測方法[25]，E6/E7基因是HPV的主要致病基因，E6基因通過抑制P53基因阻斷細胞凋亡，E7基因可抑制RB基因而使細胞周期失調控。相比于HPV DNA檢測，E6/E7 mRNA表達水平提示的是有轉錄活性的病毒的存在，是目前HPV檢測的重要手段。研究顯示：RNA ISH敏感性為97%，與p16 IHC具有較高的一致性(93%)[26]。一項愛爾蘭數據以p16 IHC陽性病人為基數，對HPV DNA ISH/RNA ISH/DNA PCR技術的敏感性及特異性進行對比，結果顯示：3種檢測方法在p16+病例中有相似的敏感性(RNA ISH為89%；DNA ISH為74%；DNA PCR為79%)，而兩種ISH技術的特異性均優于DNA PCR(RNA ISH為100%；DNA ISH為100%；DNA PCR為67%)。該研究認為，3種方法中準確性最高的是HPV RNA ISH(95%)，其次是HPV DNA ISH(90%)，而HPV DNA PCR最低(72%)[23]。隨著HPV陽性的OPSCC的研究進展，用于檢測HPVE6/E7基因的廣譜雞尾酒探針已經可檢測多種HPV亞型的E6/E7基因，從而擴大了HPV的檢出率[27]。RNAscope技術是最新的原位雜交技術，其RNA探針敏感性高于PCR-反向斑點雜交，解決了FFPE中mRNA降解的問題[28]。研究顯示，以p16 IHC為參考，RNAscope技術檢測HPV的敏感性為93.4%[29]。然而，當檢測多種高危型HPV(如HPV16、18、52、53等)時，則需要使用多種探針，檢測費用較昂貴。

3.4 PCR檢測HPV RNA

FFPE腫瘤組織中RNA存在降解，提取的核酸量少、質量低，并且常是片段的或經過化學修飾的RNA，給RNA PCR檢測方法帶來了挑戰。另外，口咽癌的組織學標本大多數為小活檢組織，FFPE切片中腫瘤組織量少，這更增加了RNA PCR檢測在臨床樣本中實施的難度。因此，關于HPV RNA PCR檢測方法的報道較少，其與HPV DNA PCR一樣有著高敏感性、低特異性、并且無法分辨腫瘤細胞中的HPV是否是存在于非腫瘤上皮或間質中的非特異性感染[30]。

Aptima HPV檢測是臨床上廣泛應用于宮頸癌篩查的方法，可同時檢出14種高危型HPV的E6/E7 mRNA，是圣地亞哥加州地區Hologic公司推出的商品化的基因檢測技術[31]。該檢測價格低廉，操作簡易，美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的適用標本是細胞學樣本，尚未批準用于FFPE標本，因此目前該方法在OPSCC患者中的應用局限在了頸淋巴結轉移灶細針穿刺樣本[32]。最近Kir等[33]在宮頸鱗狀上皮內病變和宮頸鱗癌中成功進行了FFPE標本Aptima HPV檢測的初步嘗試，為擴大Aptima HPV檢測在OPSCC中的應用賦予了希望。

4 小結和展望

雖然中國HPV相關的OPSCC患者比例低于歐美，但鑒于其獨特的臨床分期和對治療的反應，精準且高效鑒別HPV陽性的OPSCC成為分子病理診斷的核心內容。并且，中國學者的研究證明第8版AJCC分期系統對于我國口咽癌患者也適用，中國臨床腫瘤學會(Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO)也在2019年V1版頭頸部腫瘤診療指南中正式采用了美國第8版AJCC分期系統[34]。HPV陽性的OPSCC有其形態學特點和p16彌漫強陽性表達的特點，但是目前指南中推薦的單獨p16 IHC判斷方法，可能會出現少數p16陽性，但并無HPV感染的病例。隨著HPV病毒特異性檢測技術的進步，尤其是具有轉錄活性的病毒E6/E7 mRNA檢測技術(如RNAscope技術和Aptima HPV技術)的普及，HPV病毒特異性檢測有可能會從現在指南中推薦的“額外的檢測”轉變為p16 IHC的聯合檢測，從而提高HPV相關OPSCC診斷的準確性，實現OPSCC的精準診斷和精準治療。