拮抗霍亂弧菌菌株枯草芽孢桿菌YB-99的篩選及在水產養殖中的應用

楊傳倫，車樹剛，張心青，陳振發，王建平，王秀芝

(黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500)

0 引言

【研究意義】水產養殖中弧菌病是一種由弧菌引起的常見病害[1]，弧菌生命力強且繁殖速度快，營養需求低，一旦養殖水體中弧菌數量未得到有效控制，弧菌會爆發性繁殖，導致水體惡化[2-3]。水產動物由于環境改變將導致機體免疫減弱，弧菌乘勢入侵，出現白便、偷死、潰爛、發育異常等癥狀[4-5]。若不及時控制水體中的弧菌，一旦爆發后果將難以預測，輕者會導致大量養殖體死亡[6]，重者將面臨絕產[7]。因此，開展弧菌病防治研究，對促進水產養殖的綠色生態持續發展具有重要意義。【前人研究進展】導致弧菌病的病原菌主要包括鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、創傷弧菌(Vibriovulnificus)等[8-9]。目前水產養殖業中弧菌病防治的主要手段仍為化學方法[10]，如抗生素與消毒劑的交替使用[11]，然而養殖過程中抗生素等化學藥劑的重復、大量使用勢必會提高弧菌的耐藥性與抗藥性，同時化學藥劑對養殖水體的污染是不可逆的[12]，更不會被水體降解，長期食用這些被化學藥劑污染的產品對人體也是百害而無利[13-14]。因此，亟需尋找能夠高效抑制水體中弧菌繁殖的且不會對水體環境造成破壞的產品或技術為水產養殖保駕護航。【研究切入點】近年來，益生菌在水產養殖中的應用研究備受關注，益生菌對水產養殖的益處是多方位的，多集中于凈化水體、促進養殖體生長、通過分泌小分子物質提高動物體免疫力及對水體中病原菌的競爭性抑制等，甄曉然等[15-16]篩選出對副溶血性弧菌具有拮抗作用的弧菌，拮抗效果達90%，但未進行應用效果評價，而且多數學者主要是針對海水養殖中的弧菌進行研究，鮮有對淡水養殖尤其是霍亂弧菌拮抗方面的研究報道[17-18]。目前，主要應用于水產養殖的微生物菌劑包括酵母菌(Yeast)、乳酸菌(Lacticacidbacteria)及芽孢桿菌(Bacillus)等[19]，由于芽孢桿菌抗逆性強、易保存、可以分泌多種不同結構的活性物質等特點，在微生態領域受到廣泛關注。【擬解決的關鍵問題】黃河三角洲京博化工研究院研究團隊多次對山東喬莊水產養殖基地取樣分析，發現養殖水體中的弧菌多為霍亂弧菌，因此以實驗室分離的霍亂弧菌為研究對象，以喬莊養殖戶中廣泛好評的弧菌清藥劑為對照，篩選分離對霍亂弧菌具有拮抗效果的菌株，從拮抗株中篩選得到效果最優的菌株并將其應用于南美白對蝦養殖中，考察拮抗菌株對水產養殖池水體霍亂弧菌的拮抗效果，為水產養殖中弧菌病生物防治提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株及水產動物 病原菌菌株霍亂弧菌(V.cholerae)為黃河三角洲京博化工研究院實驗室菌種庫保存，分離自山東喬莊水產養殖基地；拮抗菌株為實驗室菌種庫保存的120株芽孢桿菌類菌株，依次命名為YB-1至YB-120；試驗水產動物為南美白對蝦，蝦苗規格0.62 g/尾。

1.1.2 試劑及培養基 MRS培養基(g/L)：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，檸檬酸三銨2 g，葡萄糖20 g，硫酸錳0.25 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.58 g，磷酸氫二鉀2 g，吐溫-80 1 mL，瓊脂20 g，蒸餾水，pH6.2～6.4；LB培養基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水，pH7.2～7.4；YPD培養基(g/L)：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母粉10 g，蒸餾水，pH自然；TCBS培養基(g/L)：酵母浸粉5 g，蛋白胨10 g，硫代硫酸鈉10 g，枸櫞酸鈉10 g，牛膽粉5 g，牛膽酸鈉3 g，蔗糖20 g，氯化鈉10 g，檸檬酸鐵1 g，溴麝香草酚蘭0.04 g，麝香草酚蘭0.04 g，瓊脂15 g，pH 8.5～8.7；弧菌清(100 g/瓶，是防治霍亂弧菌的常用藥劑),購買自上海西格生物科技有限公司。

1.1.3 試驗器材 恒溫振蕩器SHY-2(THZ-82),常州中捷精密機械有限公司；生化培養箱BJPX,山東博科生物產業有限公司；電子天平FB124，上海齊強儀器制造有限公司；滅菌鍋YXQ-75G，上海博迅實業有限公司；超凈工作臺VS-840，蘇州尚田潔凈技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌株的篩選

1)拮抗菌株初篩。采用濾紙片法[20]，分別將活化后的病原菌(霍亂弧菌)和拮抗菌株接種入新鮮的無菌LB液體培養基中，培養過夜，取100 μL指示菌涂布于新鮮的TCBS固體培養基中，用無菌打孔器在涂過指示菌的平板上等距離打2個直徑10 mm已滅菌孔，取10 μL待測菌液滴于孔內，同時設置弧菌清藥劑(稀釋1 000倍后取10 μL滴于孔內)作為對照，然后35℃培養箱中培養過夜，24 h左右觀察孔周圍是否出現抑菌圈并測量其直徑，初步篩選拮抗菌株。

2)拮抗菌株復篩。采用共培養法[20]，分別刮取活化后的拮抗菌株和霍亂弧菌接種到LB液體培養基中培養過夜，分別吸取200 μL霍亂弧菌和拮抗菌菌液接入同一個裝有100 mL稀釋5倍的液體LB培養基的錐形瓶內共培養，以未接種拮抗菌株的LB液體培養基為對照，37℃、150 r/min培養過夜，16 h后采用10倍遞增稀釋法稀釋，選擇合適濃度(平板上菌落數30～300個為宜)涂布于新鮮的 TCBS固體培養基中，放入恒溫生化培養箱培養24 h，考察拮抗菌株對霍亂弧菌的拮抗率，篩選最優拮抗菌株。

1.2.2 拮抗菌株對霍亂弧菌的拮抗試驗

1)實驗室接種試驗。4℃冰箱中取出拮抗菌株平板，在超凈工作臺用無菌的接種環小心挑取平板上的單菌落接種于100 mL無菌LB液體培養基中，37℃、180 r/min震蕩培養24 h。于500 mL錐形瓶中加入100 mL喬莊南美白對蝦養殖水。取25 mL培養完成的拮抗株發酵液，4 500 r/min離心5 min，倒掉上清液，將離心后的菌體接入養殖水中(處理組)，同時以未接種拮抗菌的為對照組，每組2個重復，37℃、150 r/min振蕩培養，每天取樣檢測弧菌變化，連續檢測3 d，即在培養24 h、48 h和72 h時考察霍亂弧菌的菌量及其拮抗菌株對霍亂弧菌的拮抗率。

2)南美白對蝦養殖池應用試驗。2020年7—9月,在山東喬莊某農戶的室外南美白對蝦養殖池開展拮抗菌株對霍亂弧菌的拮抗試驗。養殖池面積1 000 m2，投殖密度約53尾/m2，蝦苗投放15 d后開始投加菌劑。4℃冰箱中取出拮抗菌株平板，在超凈工作臺用無菌接種環挑取平板上的單菌落接種于100 mL無菌LB液體培養基中，37℃、180 r/min震蕩培養16 h后轉接入1 L無菌LB液體培養基中，37℃、180 r/min震蕩培養24 h，按照此方法制備10 L拮抗菌株發酵液待用。取10 L培養完成的拮抗菌株發酵液，4 500 r/min離心5 min，倒掉上清液，離心后的菌體接入其中1個養殖池中(處理組)，同時以施用弧菌清藥劑處理的為對照組。試驗開始后每隔15 d取樣1次，連續取樣5次，按照平板涂布方式檢測水體中弧菌菌量。養殖池出蝦時進行蝦重、成活率等生物量的檢測。

1.3 數據統計分析

采用Excel、Microsoft PowerPoint和SPSS等進行數據統計與分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗霍亂弧菌的枯草芽孢桿菌YB-99的獲得

初篩選結果表明，在120株芽孢桿菌中，YB-9、YB-45、YB-95、YB-95、YB-96、YB-99、YB-119菌株對霍亂弧菌的抑菌圈直徑極顯著大于對照藥劑(弧菌清)，其中以菌株YB-99的抑菌圈直徑最大，達2.20 cm。因此，初步判斷該6株菌株對霍亂弧菌具有拮抗效果。對初篩獲得的6株拮抗菌株進行共培養復篩，結果(表1)表明，對霍亂弧菌拮抗率最高的菌株為YB-99，拮抗率達96.80%。復篩與初篩結果高度吻合，因此選取菌株YB-99為霍亂弧菌拮抗菌株。

表1 6 株弧菌拮抗菌株對霍亂弧菌的拮抗率Table 1 The antagonistic rate of 6 strains against V. cholerae

2.2 枯草芽孢桿菌YB-99對霍亂弧菌的拮抗率

從表2看出，在實驗室接種試驗中，接種拮抗菌株YB-99的處理連續3 d即接種72 h內對霍亂弧菌的拮抗率都保持90%以上，且隨接種時間推延拮抗率呈上升趨勢。另外，同一考察時間，空白對照的弧菌菌量遠高于接種拮抗菌株YB-99的處理，說明菌株YB-99在短時間內可有效抑制弧菌的快速繁殖。

表2 不同接種時間枯草芽孢桿菌YB-99對霍亂弧菌的拮抗率Table 2 The antagonistic rate of B. subtilis YB-99 against V. cholerae with different inoculation time

2.3 枯草芽孢桿菌YB-99在南美白對蝦養殖池的應用效果

2.3.1 抑制弧菌繁殖 從圖1可知，添加枯草芽孢桿菌YB-99的處理養殖池中霍亂弧菌菌量隨養殖時間延長略有增加，但變幅不大，一直保持在安全限值(小于103cfu/mL)[21]以內，處理75 d時霍亂弧菌菌量為4.01×102cfu/mL。對照組(施用弧菌清)的弧菌菌量隨養殖時間延長呈上升趨勢，處理45 d時弧菌菌量由初始的1.55×102cfu/mL升至1.97×103cfu/mL，已超出安全限值；處理75 d時弧菌菌量升高至8.84×103cfu/mL。表明，枯草芽孢桿菌YB-99對弧菌繁殖具有抑制作用，其抑制效果明顯優于對照藥劑弧菌清。

圖1 不同處理養殖池霍亂弧菌的菌量Fig.1 The number of V. cholerae with different treatments

2.3.2 促進南美白對蝦生長 從表3看出，不同抑菌處理養殖池南美白對蝦的生長存在較大差異。添加枯草芽孢桿菌YB-99處理的對蝦成活率為92.81%，蝦重為21.74 g/尾，池塘出蝦量1 372 kg，3項指標均明顯高于對照組(施用弧菌清)，原因是對照組池塘的弧菌量超限，對南美白對蝦的養殖造成一定負面影響。說明，枯草芽孢桿菌YB-99對霍亂弧菌的拮抗效果優于藥劑弧菌清，施用枯草芽孢桿菌YB-99后可促進對蝦健康安全生長。

表3 不同抑菌處理養殖池南美白對蝦的生長情況Table 3 Growth status of P. vannamei cultured under different antimicrobial treatments

3 討論

隨著對蝦養殖業的快速發展，逐漸成為我國水產養殖的支柱[21]，由于對蝦對水體及環境的敏感性，弧菌病等爆發性流行疾病對對蝦養殖是致命性打擊，然而近年來抗生素類藥劑泛濫使用使水體中病原菌產生抗藥性，且對水體環境造成不可逆的污染，尋求安全高效的弧菌病防治技術是對蝦養殖業多年來的關注焦點。生物拮抗技術以調節水體微生態環境為手段達到水體凈化的效果[22]，對水環境及養殖體不會產生二次污染，而且在增強動物體免疫力及生長方面效果顯著，因此該技術近年來得到廣泛應用。

生物拮抗技術的關鍵是高效拮抗株的篩選，黃河三角洲京博化工研究院從菌株的安全性及應用現場水體環境出發，以實驗室菌種庫中保存的120株芽孢桿菌為篩選對象進行試驗，分別通過初篩與復篩確定高效拮抗株，通過微生態技術實現養殖水體中霍亂弧菌的高效拮抗，不但保護了水產養殖體免受弧菌的危害，而且對養殖環境不會產生破壞，是一種可持續低成本的養殖方法，具有化學方法所無法比擬的優勢。

4 結論

黃河三角洲京博化工研究院實驗室通過初篩與復篩獲得高效拮抗霍亂弧菌的枯草芽孢桿菌YB-99，將其應用于南美白對蝦養殖中，能夠抑制霍亂弧菌的繁殖，施用枯草芽孢桿菌YB-99處理75 d時養殖池的霍亂弧菌菌量為4.01×102cfu/mL，在弧菌菌量安全限值(小于103cfu/mL)以內；而弧菌清對照組處理45 d時養殖池的弧菌菌量達1.97×103cfu/mL，已超出安全限值；處理75 d時弧菌菌量升高至8.84×103cfu/mL。說明養殖池中施用枯草芽孢桿菌YB-99可有效抑制弧菌繁殖。

施用拮抗菌枯草芽孢桿菌YB-99的養殖池南美白對蝦成活率達92.81%，較弧菌清對照組提高9.1%；出蝦時蝦重為21.74 g/尾，較對照組提高13.04%；施用YB-99菌組的南美白對蝦收益較對照組提高18.38%。總體看，枯草芽孢桿菌YB-99抑制養殖池中弧菌生長，保護蝦體免受弧菌侵染，從而提高對蝦的成活率與收益。