艾灸對阿爾茨海默病小鼠海馬區突觸超微結構的影響*

林瑤，趙百孝

北京中醫藥大學，北京 100029

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種常見的神經系統退行性疾病，其主要病理特征為老年斑、神經纖維纏結、神經元和突觸的丟失等，臨床表現為漸進的認知功能受損、人格改變等癥狀［1-2］。癡呆患者人數在全球已逾5千萬，并隨人口的老齡化逐年升高，其治療和護理費用已成為沉重的經濟負擔。

研究發現，突觸的病變可能是AD病理進程中的重要環節［3-5］。AD腦內突觸的病理學變化主要表現為突觸功能障礙［6］、突觸形態結構損傷［7］和突觸丟失［8-9］，且該變化可能在AD早期就已經出現，并導致了認知功能的障礙［10］。研究發現，對AD模型小鼠施加相應干預措施修復突觸損傷后，認知功能減退的癥狀也隨之減輕［11-13］。突觸的病變可見于AD腦內的海馬、內嗅皮質、額葉等區域，其中以海馬區，尤其是CA1區突觸的損傷與學習記憶能力減退的關系最為密切［14-15］。

艾灸干預可延緩AD相關的病理進程并提高認知能力，治療AD具有一定的優勢。但關于艾灸對AD模型腦內突觸超微結構的影響尚未見報道。為進一步探究艾灸的作用機制，本研究以艾灸關元穴為干預方式，從突觸結構的角度，探究艾灸對AD模型小鼠學習記憶能力和海馬區突觸形態結構的影響。

1 材料

1.1 動物18只6月齡雄性SPF級快速老化小鼠（senescence-accelerated mouse prone／8，SAMP8）及9只同月齡雄性正常老化小鼠（senescence-accelerated mouse／sesistance1，SAMR1），體質量（30±3）g，購于中科澤晟科技有限公司［許可證號：SCXK（京）2014-0011］。飼養于北京中醫藥大學SPF級實驗室，室溫為（22±2）℃，濕度為50%～60%，12 h光照和黑暗交替循環，小鼠自由攝食飲水。所有操作均遵循北京中醫藥大學動物倫理委員會的規定，倫理批號：BUCM-4-2018060406-2010。

1.2 試劑特制艾條（河南南陽漢醫艾絨有限公司，規格：φ0.5 cm×18 cm）；40 ng·L-1多聚甲醛（Mreda，貨號：m051361）；25 ng·L-1戊二醛溶液（Acros，貨號：c11998）、枸櫞酸鉛溶液（南京森貝伽生物科技有限公司，貨號：A93278）；體積分數3%醋酸雙氧鈾染色液（北京生東科技有限公司，貨號：130452）；鋨酸（上海勁馬生物科技有限公司，貨號：C311498）；環氧丙烷（上海桑戈生物科技有限公司，貨號：E117349）。

1.3 儀器Epon812包埋劑（上海易微信息科技有限公司，貨號：RS116119）；透射電子顯微鏡（美國賽默飛，型號：TECNAISPIRIT）；超薄切片機（德國萊卡，型號：ULTRACUT UCT／UC6）；小鼠固定器（北京冀諾泰公司，規格：150 cm×65 cm）；Morris水迷宮實驗儀（上海欣軟信息科技有限公司，型號：XRXM101）。

2 方法

2.1 小鼠分組用隨機數字表法將SAMP8小鼠隨機分為模型組和艾灸組，每組9只，9只SAMR1小鼠為空白組。艾灸組小鼠被實驗人員束縛于專用固定器中，以艾條灸關元穴20 min。模型組和空白組小鼠采取相同抓取并固定20 min，但不做其他干預措施。每天干預1次，每周干預6 d，共持續6周。艾灸時不斷調節艾條與小鼠關元穴的距離，以維持艾灸溫度的恒定。

2.2 檢測小鼠學習記憶能力干預治療6周后，采用Morris水迷宮實驗檢測各組小鼠學習記憶能力。水迷宮的實驗裝置為一個圓形水池（高60 cm，直徑150 cm），被平均分為4個象限，其中平臺（直徑5 cm）位于第三象限，每個象限的池壁上貼有相應的標記物。在定位航行實驗中，小鼠面朝池壁從一、二、四象限依次被放入水中，若小鼠在60 s內爬上平臺，使其在平臺停留10 s，并將其找到平臺所用時間記錄為逃避潛伏期；若小鼠在60 s內未找到平臺，則會被引導至平臺，停留10 s，記錄逃避潛伏期為60 s。該實驗共持續4 d。定位航行實驗結束24 h后進行空間探索實驗：實驗人員移走平臺，將小鼠從第一象限面向池壁放入水中，記錄小鼠60 s內穿越平臺次數、目標象限游程比、目標象限停留時間比。

2.3 透射電鏡觀察小鼠突觸超微結構Morris水迷宮實驗后，每組隨機選取3只小鼠，用透射電鏡觀察其海馬CA1區神經元突觸的形態結構，并計算突觸界面結構參數。具體步驟：用體積分數10%水合氯醛麻醉小鼠，并以40 ng·L-1多聚甲醛灌注后，取小鼠海馬CA1區組織1 mm3大小用25 ng·L-1戊二醛固定液固定，1%鋨酸再固定，乙醇逐級脫水后，Epon812包埋，超薄切片。樣品經醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色后，用透射電鏡觀察各組小鼠海馬CA1區Gray I型突觸的超微結構。每只小鼠隨機選取10個突觸，每組小鼠共選取30個突觸，計算突觸界面結構參數。其中，突觸間隙的寬度采用多點平均法測量，突觸后致密物（postsynaptic density，PSD）厚度測量參照Guldner［16］的方法，突觸界面曲率測量參照Jones等［17］的方法。

2.4 統計學方法采用SPSS 20.0統計軟件處理數據。若數據符合正態分布且方差齊，即以平均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，并用LSD法進行兩兩比較；否則采用非參數檢驗。定位航行實驗結果采用重復測量數據方差分析。P＜0.05被認為有統計學意義。

空間探索實驗顯示：與空白組比較，模型組小鼠穿越平臺次數、目標象限停留時間比、目標象限游程比顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，艾灸組小鼠目標象限游程比顯著減少（P＜0.05），穿臺次數、目標象限停留時間比無顯著性差異（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠空間探索實驗結果

3.2 艾灸對小鼠海馬CA1區突觸超微結構的影響

各組小鼠海馬CA1區突觸形態：空白組小鼠突觸結構清晰、完整，突觸小泡豐富且分布密集，PSD較厚；模型組小鼠突觸結構模糊不清，突觸小泡減少，PSD變薄；艾灸組小鼠突觸結構較清晰，突觸小泡較多、分布較密集，PSD較厚。見圖3。

圖3 各組小鼠海馬CA1區突觸超微結構（×26 500）

3 結果

3.1 艾灸對小鼠記憶的影響定位航行實驗顯示：各組小鼠的平均逃避潛伏期隨著訓練天數的增加呈現下降趨勢。與空白組比較，模型組小鼠平均逃避潛伏期顯著升高（P＜0.05）。訓練最后一天，與模型組比較，艾灸組小鼠平均逃避潛伏期均顯著下降（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠定向航行實驗平均逃避潛伏期

各組小鼠海馬CA1區突觸界面結構參數：與空白組比較，模型組突觸界面曲率、PSD厚度顯著減小，突觸間隙顯著增寬（P＜0.01）；與模型組比較，艾灸組突觸間隙顯著減小，PSD厚度顯著增大（P＜0.05），突觸界面曲率無顯著性差異（P＞0.05）。見圖4。

圖4 各組小鼠海馬CA1區突觸界面結構參數

4 討論

關元穴是足三陰經和任脈的交會穴，具有溫腎壯陽、培補元氣的作用。《扁鵲心書》也記載：“人于無病時，常灸關元、氣海、命門、中脘，雖未得長生，亦可保百余年壽矣”，認為艾灸是益壽延年的抗衰老要穴［18］。本課題組前期研究發現，艾灸關元穴可以通過調節線粒體功能-能量代謝途徑改善AD模型小鼠腦內氧化應激狀態、減輕神經元的凋亡［19］，通過上調PI3K／AKT通路，減少腦內β淀粉樣蛋白的產生［20］，通過mTOR信號通路提高海馬的自噬水平，減少Aβ及磷酸化tau蛋白含量［21］，調節海馬突觸可塑性相關蛋白的表達［22］等途徑提高AD模型小鼠的學習記憶能力，說明艾灸治療AD具有多靶點的優勢。本研究從突觸的角度進一步探究了艾灸治療AD的作用機制。

突觸由突觸前膜，突觸間隙和突觸后膜構成，負責傳遞神經元的信息，是學習記憶產生的關鍵部位［23］。突觸界面結構參數定量描述了突觸超微結構的變化，是突觸形態結構變化的客觀指標［24］。目前常用的突觸界面結構參數有突觸間隙寬度、突觸界面曲率、PSD厚度、突觸活性帶長度等［25］。PSD是一層位于突觸后膜的致密物質，含有神經遞質受體、信號分子以及細胞骨架蛋白等，其厚度與突觸功能呈正相關［26］。突觸間隙是突觸間的縫隙，該間隙的增大會增加神經遞質傳遞時的損耗，因此突觸間隙的寬度與神經遞質傳遞效率呈負相關。突觸界面曲率描述了突觸連接界面的彎曲程度，體現突觸接觸面積的大小，與神經遞質傳遞效率呈正相關［27］。

目前研究發現，AD模型小鼠學習記憶能力下降，腦內突觸形態結構異常，而針灸干預可改善突觸結構并提高AD模型小鼠認知功能［28］。李斐斐等［29］發現，SAMP8小鼠經電針治療后電鏡下海馬CA1區突觸形態結構改善，突觸小泡增多，學習記憶能力增強，與王穎等［30］和楊文丹等［31］的研究結果類似。此外，盧圣鋒等［32］發現電針SAMP8小鼠的“百會”“涌泉”穴后，其學習記憶能力顯著增強，海馬區突觸間隙減小且PSD增厚，但突觸界面曲率無顯著性差異。類似的研究也表明，電針治療可緩解AD鼠認知障礙，使海馬區突觸間隙減小，PSD增厚、突觸界面曲率增大［33］。本研究結果顯示，SAMP8小鼠經艾灸治療后Morris水迷宮行為學成績提高，電鏡下可見其海馬區突觸超微結構改善，突觸間隙顯著減小、PSD顯著增厚，與上述研究結果一致。

本研究發現，與模型組比較，經艾灸關元穴6周后，SAMP8小鼠Morris水迷宮平均逃避潛伏期顯著縮短，空間探索實驗的目標象限游程比顯著升高，電鏡下突觸超微形態結構改善，突觸間隙顯著減小、PSD顯著增厚，提示艾灸能夠修復受損的突觸結構，增強海馬神經元的功能，提高AD模型小鼠的學習記憶能力。

綜上所述，艾灸關元穴能夠提高阿爾茨海默病模型小鼠的學習記憶能力，作用可能與其促進突觸形態結構的恢復有關。