應用16S rDNA測序分析肝、腎膿腫的病原菌特點

郭雅文，暢智慧

(中國醫科大學附屬盛京醫院放射科，遼寧 沈陽 110004)

肝膿腫和腎膿腫是常見的腹腔內感染性疾病，可進一步導致膿毒性休克并危及生命，且這類疾病的發病率有逐年增加趨勢[1-3]。臨床上主要依賴傳統的細菌培養確定膿腫的致病菌，對于罕見的、生長緩慢的和不可培養的細菌均無法通過傳統的細菌培養檢測出來[4]。近年來，16S rDNA測序技術已經用于胸腔感染、膽道感染及腦膿腫的致病菌檢測，且診斷效能優于傳統培養[3]，但在肝、腎膿腫中卻鮮有報道。肝膿腫的致病菌多經門靜脈或膽道途徑入肝[5]，而腎膿腫則多為血源性或泌尿道逆行感染[6]，兩者的常見致病菌存在差異。16S rDNA技術能分析微生物群體的多樣性、豐富度及群體結構等，為深入分析肝、腎膿腫的病原菌構成提供了新的方法[7]。本研究對肝膿腫和腎膿腫引流液進行16S rDNA測序，旨在比較16S rDNA測序及傳統培養方法在肝、腎膿腫病原菌檢測中的價值，分析肝膿腫和腎膿腫中病原微生物的構成差異，了解肝、腎膿腫病原菌的特點。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2019年12月—2020年12月共32例腹腔膿腫患者納入本研究，其中肝膿腫24例 ，腎膿腫8例。患者年齡及性別分布見表2。32例患者其中男性18例(肝膿腫17例，腎膿腫1例)，女性14例(肝膿腫7例，腎膿腫7例);肝膿腫組年齡為29～80歲，平均年齡(60.54±14.28)歲；腎膿腫組年齡為37～76歲，平均年齡(51.75±14.82)歲。所有患者均進行經皮穿刺引流聯合抗菌藥物治療，常規應用的抗生素為頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉或美羅培南；對于頭孢類抗生素過敏的患者，應用鹽酸莫西沙星。

表2 肝膿腫組和腎膿腫組患者臨床特征比較

1.2 標本收集 經皮穿刺引流膿腫時，使用超聲引導下穿刺膿腫，抽出膿液，一式兩份，分別進行傳統培養和16S rDNA測序。患者的標本編號為肝膿腫(liver abscess，LA)和腎膿腫(renal abscess，RA)。

1.3 傳統培養 膿腫引流液常規接種培養后進行菌種鑒定，相關操作均由醫院檢驗科微生物室完成。其中菌種鑒定采用VITEK全自動分析儀(法國生物梅里埃公司)，結果參照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)標準進行判定。

1.4 16S rDNA測序 使用E.Z.N.A.?Stool DNA試劑盒(D4015, Omega, Inc.，USA)從標本中提取DNA，-80℃保存，由浙江杭州聯川科技有限公司進行PCR檢測。使用引物341F (5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’) 和 805R (5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)[8]對 16S rDNA (V3+V4)可變區進行 PCR 擴增。純 化 后 的 PCR 產 物 采 用 Quant-iTPicoGreen dsDNA Assay Kit 在 Qbit 熒光定量系統上對文庫進行定量，合格的文庫濃度應在 2 nM 以上。使用 NovaSeq 測序儀進行 2×250 bp 的雙端測序。以 SILVA 數據庫注釋結果為準。Alpha 多樣性和 Beta 多樣性通過抽平(將所有標本的序列數抽取至最少序列標本的序列數)的方式進行歸一化,物種注釋使用相對豐度進行歸一化處理。 Alpha 多樣性以及 Beta多樣性均用QIIME2平臺進行流程分析，圖片由 R (v3.5.2)包繪制。物種注釋采用 QIIME2 的插件feature-classifier 進行序列比對，比對數據庫為 SILVA 和 NT-16S 數據庫。

2 結果

2.1 16S rDNA測序與細菌培養結果比較 32例標本，26例(81.25%)患者膿腫引流液細菌培養陽性，而16S rDNA測序陽性率為100%，定義16S的單獨致病菌為reads>96%[4]。見表 1。

表1 標本細菌培養和16S rDNA測序結果比較

2.2 肝、腎膿腫患者的臨床特征 肝腎膿腫患者均有發熱、腹痛、乏力等不適，兩組患者在性別、腰痛癥狀方面差異均有統計學意義(均P<0.05)，在基礎疾病及膿腫影像表現方面差異均無統計學意義(均P>0.05)。

2.3 肝、腎膿腫檢出病原菌差異 Chao1指數反映標本的物種豐富程度，分析顯示，肝膿腫組Chao1指數與腎膿腫組，差異無統計學意義，提示肝膿腫組的物種豐度與腎膿腫組相近。見圖1。堆疊柱狀圖中可以看出肝膿腫和腎膿腫在屬一級別的菌種組成存在差異，其中橫坐標為組別，縱坐標為相對豐度，不同的顏色代表了不同的菌屬。見圖2。主成分分析(principal component analysis,PCA)：肝膿腫組和腎膿腫組組內標本離得很近，但兩組間距離相對較遠，進一步表明兩組間微生物組成差異明顯。見圖3。

采用線性判別式分析(linear discriminant analysis, LDA)進一步分析肝、腎膿腫病原存在差異的物種，LDA圖提示，肝膿腫組菌群以變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科、克雷伯菌屬為主要特征差異細菌菌類；腎膿腫組菌群以叢毛單胞菌科、分枝桿菌科、變形桿菌屬、短芽孢桿菌屬、解纖維素根瘤菌屬、毛螺菌屬、纖毛菌屬、嗜糖假單胞菌屬、分枝桿菌屬、Thermicanus菌屬以及Saccharimonadaceae菌屬為主要特征差異細菌菌類。見圖4。

3 討論

目前，臨床上仍主要采用傳統培養方法鑒定細菌。然而培養的細菌鑒定成功率卻比較低，因為標本中存在生長緩慢或不可培養的細菌。除此之外，傳統培養比較耗時，不利于臨床工作的進一步開展。隨著DNA測序和PCR技術的日益普及，16S rDNA測序逐漸成為一種強有力的菌群鑒定方法，其比傳統的細菌培養準確性更高，能鑒定出的菌種更多。本研究將16S rDNA測序用于肝、腎膿腫的病原菌檢測，結果表明該技術對病原菌的檢測能力優于傳統培養。另外，對于傳統培養獲得病原菌結果的標本，16S rDNA還能夠鑒定出優勢菌以外的其他菌屬，有利于更加深入了解膿腫內的微生態。

本研究顯示，肺炎克雷伯菌是導致肝膿腫的主要病原菌，與以往研究[1,10-11]相符。16S rDNA測得的結果顯示，引起肝膿腫的其他致病菌還包括腸球菌屬、普雷沃氏菌屬、寡養單胞菌屬、擬桿菌屬等，這些細菌大多是腸道定植菌。肝臟受肝動脈及門靜脈的雙重供血，并經膽道與胃腸道相通，受細菌感染的機會較大[12-14]。本組肝膿腫病例可能大多是因腸道微生物突破腸黏膜屏障，經門靜脈途徑導致的。本研究中8例腎膿腫患者中除RA2、RA4的優勢菌屬為克雷伯菌屬外，其余幾個標本的優勢菌屬為葡萄球菌屬、變形桿菌屬，以及腸球菌屬。其中克雷伯菌屬及變形桿菌屬是革蘭陰性桿菌，是泌尿系統感染的常見致病菌，可逆行導致腎膿腫[10,15]，葡萄球菌屬和腸球菌屬也是引起尿路感染的常見細菌[2,16]。由此推測本組腎膿腫主要為泌尿系統逆行感染所致。

利用16S rDNA測序數據進一步分析肝、腎膿腫內的菌群特征。Alpha 多樣性中的Chao1指數提示肝、腎膿腫的菌群豐度相近；Beta多樣性分析中，PCA能明顯區別兩類膿腫的菌群，提示菌群構成存在顯著差異；LDA進一步探索差異的菌群，結果發現腎膿腫組主要的病原菌為變形桿菌屬等，而肝膿腫組主要的病原菌為克雷伯菌屬以及腸桿菌屬等，可能是由兩種膿腫發病途徑不同所致。不同的菌群結構將引起不同的代謝特征，以及不同的臨床癥狀。本研究為后續基于膿腫的菌群特征，研究膿腫的臨床特點提供了新的思路。

當然，16S rDNA測序也存在一些不足。首先，16S rDNA測序無法提供細菌的藥敏試驗結果。其次，基因測序是一種相對昂貴的鑒定方法，因此不建議將其作為臨床常規檢查，但是對于傳統培養陰性，并且需要進一步明確致病菌以指導臨床用藥的情況，基因測序是一種好的選擇。另外，16S rDNA技術僅能在屬水平上區分細菌，未具體到種水平。下一步考慮進行宏基因組測序，以將病原菌構成精確到種一級，并進行相關功能學研究[17-18]。

綜上所述，16S rDNA測序可檢測傳統培養陰性的病原菌，肝、腎膿腫病原菌組成存在差異，16S rDNA測序是深入了解肝腎膿腫病原菌特點的有效方法。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。