雙向電泳指紋圖譜分析法鑒別鮮乳和復原乳

王海艷，李 昕，石新華，蒙 嶸，李鳳利，張小玲，盛萬里

（1.呼和浩特海關，內蒙古呼和浩特 010020；2.內蒙古自治區農牧業技術推廣中心，內蒙古呼和浩特 010010）

復原乳是將無水奶粉和水混合加工處理后制成的液體乳，其成分因多次高溫處理而受到破壞，導致部分蛋白、生物活性成分和免疫因子消失，因此可以基于這些特點，利用區分蛋白的技術手段，將復原乳與鮮乳區分開來。雙向電泳技術（2DGE）是目前分辨率最高、唯一可同時分離上千種蛋白質的方法。該技術利用蛋白質等電點和相對分子質量的不同分離蛋白質：首先依據等電點不同，將不同凈電荷的蛋白質進行分離，然后再依據相對分子質量的不同通過SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同蛋白點進行分離。因此，2DGE 是一種宏觀、可量化的技術手段，具有分辨能力強、重現性好等優點，被廣大科研工作者用于科學研究[1]。該技術過去曾用于中藥材真偽鑒別[2]，并得到美國食品藥品管理局和世界衛生組織的認可[3-4]。近年來，我國也將該方法應用于食品過敏原研究并取得滿意結果[5-6]。本研究探討采用2DGE 對鮮乳和復原乳進行真偽鑒別的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳及乳粉樣本 鮮乳，采集于內蒙古呼和浩特市郊區某奶牛養殖場；巴氏乳、乳粉以及巴氏處理的復原乳，購于某大型超市。

1.1.2 主要試劑 7 cm、17 cm ReadyStrip（pH3.0～10.0、3.9～5.1、4.0～7.0、4.7～5.9、5.5～6.7）膠條，IPG 緩沖液（pH3.0～10.0、3.9～5.1、4.0～7.0、4.7～5.9、5.5～6.7），2DGE 相關試劑，購自美國BIO-RAD 公司；BCA Protein Assay kit 蛋白定量試劑盒，購自美國Novagen 公司。

1.1.3 主要設備 2DGE 系統和蛋白掃描儀，購自美國BIO-RAD 公司。

1.2 方法

1.2.1 牛乳樣品雙向電泳條件選擇 將原乳樣品常溫下1 500g離心20 min 后，去除上層脂肪，測定蛋白質質量濃度后備用；按照2DGE 系統和膠條使用說明書進行第一向和第二向電泳，電泳結束后先用考馬斯亮藍染色，再用蛋白掃描儀掃描圖像。

1.2.1.1 第一向等電聚焦 取出冷凍保存的水化上樣緩沖液1 mL 置室溫溶解，在管中加入0.01 g DTT 和5 μL Bio-Lyte 后混勻，然后各取500 μL 分別加入4、6、8、10 μL 乳樣并混勻；取出冷凍保存的不同pH 的7 cm 和17 cm IPG 預制膠條，置室溫10 min，沿水化盤中槽的邊緣從左至右加入樣品，再將IPG 膠條膠面朝下置于水化盤中樣品溶液上；在每根膠條上覆蓋2 mL 礦物油；蓋上蓋子，按等電聚焦程序進行分離。等電聚焦后立即進行平衡和第二向SDS-PAGE 電泳，如果不能及時進行下一步實驗，則置于-70 ℃冰箱保存。

1.2.1.2 第二向SDS-PAGE 電泳 配制10%的丙烯酰胺凝膠2 塊；從-20 ℃冰箱中取出膠條，于室溫放置10 min，使其溶解，按照操作說明書要求將膠條進行平衡后將其浸在1×電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在有凝膠的長玻璃板上；將放有膠條的SDS-PAGE 凝膠轉移到灌膠架上，在凝膠上方加入低熔點瓊脂糖封膠液，用鑷子輕輕向下推膠條，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸，待徹底凝固后進行電泳；電泳結束后再進行染色。

1.2.2 不同牛乳樣品雙向電泳比較 將采集于某奶牛場的新鮮乳去除上層脂肪自制成原乳、巴氏乳和超高溫瞬時滅菌乳（UHT 乳），將乳粉制成巴氏處理的復原乳。將這4 種樣品調整為總蛋白量基本一致，參照1.2.1 的方法電泳、染色和蛋白分析。

1.2.3 實際樣品檢測 采用pH4.7～5.9 的17 cm膠條，對市場上購買的巴氏乳以及巴氏處理的復原乳進行電泳分析，方法同1.2.1。

2 結果與分析

2.1 牛乳樣品雙向電泳條件選擇

以脫脂原乳為樣品，選擇不同pH 的7 cm 和17 cm 膠條進行比較。結果（圖1）可見：牛乳的主要蛋白點都集中在pH4.0～7.0 范圍內，pH4.7～5.9和pH4.0～7.0 的膠條等電聚焦后均能夠有效區分蛋白點，但是pH4.7～5.9 蛋白點最清晰，且17 cm 比7 cm的膠條蛋白點更清晰，比較適合牛乳蛋白電泳。

2.2 不同牛乳樣品2DGE 比較

將原乳、巴氏乳、UHT 乳、巴氏處理復原乳4 種樣品調整為總蛋白量基本一致后進行2DGE 試驗。結果（圖2）顯示：隨著熱處理強度的增加，蛋白點著色變淺。通過軟件分析，將參數設置為巴氏乳蛋白含量比復原乳高2 倍以上時，有10 個蛋白點滿足該條件（圖3）。

2.3 實際樣品檢測

為進一步驗證該鑒定技術的可行性，對市售的幾種巴氏乳和復原乳產品進行分析，結果發現巴氏乳圖譜與自制參照乳圖譜基本一致，而復原乳蛋白點明顯變少，著色變淡甚至模糊（圖4）。

3 討論

與鮮乳相比，復原乳的營養作用有所降低。國務院辦公廳在《關于加強液態乳生產經營管理的通知》中明確要求，復原乳生產商必須在產品包裝上明確標注“復原乳”字樣。但仍有部分復原乳生產企業未按要求進行標注，因此急需建立有效檢測方法開展市場監管工作，以保證乳品市場健康發展。

2DGE 主要應用于蛋白領域的研究工作，包括總蛋白、不同蛋白質差異表達和蛋白修飾等，通過與標準蛋白比對，即可獲得檢測蛋白的等電點和相對分子質量等相關信息，從而建立有效的數據庫。該技術已被廣泛應用于醫學領域。例如，通過斑點對比可檢測到差異蛋白，從而發現引起疾病的相關蛋白，并可查找到診斷疾病的相關標記因子，也可通過查找與疾病相關的蛋白藥靶，用于疾病致病機理研究等[7]。

目前最常用的蛋白染色方法是考馬斯亮藍染色法和銀染法：考馬斯亮藍染色具有操作簡便、毒性低和重復性好等優點而被廣泛使用[8]，但其靈敏度低，導致低豐度蛋白難以顯現；銀染法是非放射性染色法中最靈敏的方法，但存在脫銀方法復雜、重復性差等缺點使其使用受限[9]。目前，有研究者正積極探索更適合區分乳中蛋白的染色方法，例如熒光染色、同位素標記、負染法等。

本研究采用雙向電泳技術，對市場上購買的鮮乳以及復原乳進行電泳分析，發現電泳圖譜與自制參照乳圖譜基本一致，可以查找到差異蛋白，是一種行之有效的區分鮮乳和復原乳的檢測方法，且該技術重現性好，可為乳品品質研究提供方法補充，從而為下一步乳品市場監管提供有力的技術支撐。