弓形蟲實驗室診斷技術研究進展

張險朋，王自強，李永福，楊得勝

（1.東莞市動物疫病預防控制中心，廣東東莞 523086；2.福建省動物疫病預防控制中心，福建福州 350003）

弓形蟲病是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的一種世界性分布的人獸共患原蟲病，在脊椎動物中廣泛傳播，對胎兒和免疫缺陷患者的感染尤其令人擔憂。多數學者認為弓形蟲是單一種、單一血清型，但不同蟲株有不同基因型[1]。根據蟲株的侵襲力、繁殖速度、包囊形成與否及對宿主的致死率等，剛地弓形蟲可分為強毒株和弱毒株，當前公認的代表毒株分別為強毒RH 株、弱毒Beverley 株[2-3]。弓形蟲于1908 年在北非突尼斯的嚙齒類梳趾鼠（Ctenodactylusgondii）體內首次被發現[4]，幾乎可以感染所有溫血動物。我國于1955 年首先在福建省的貓、兔等動物體內發現了弓形蟲[5]，1964 年首次報告病例，但直到1977 年才引起重視。

弓形蟲生長周期需要兩個宿主：中間宿主廣泛，多種冷血、溫血動物都會被感染，終末宿主則是貓科動物[6-7]。弓形蟲的生活史包括有性和無性兩個生殖階段，有性生殖只在終末宿主貓科動物的小腸上皮細胞內進行。生活史包括滋養體、包囊、裂殖體、配子體和卵囊等五種形態，前兩種形態見于中間宿主和終宿主體內，后三種形態見于終宿主體內[8]。弓形蟲包囊或卵囊隨食物被貓科動物吃入后，便侵入小腸上皮細胞內開始增殖，其中一部分蟲體從腸道中逸出，經腸系膜淋巴結向全身各器官擴散，并發育為速殖子和包囊體，完成無性生殖過程；另一部分蟲體在小腸內繁殖成為大、小兩種配子體，而后分別產生雌、雄配子，雌雄配子結合為合子，合子再發育為卵囊[9]。在合適條件下卵囊成熟，當中間宿主吃進成熟卵囊后，引發弓形蟲病。

弓形蟲病是一種機會性致病原蟲病，多為隱性感染，無明顯臨床癥狀，很少發現健康宿主出現嚴重病癥。王玉燕等[10]2017 年5—6 月對徐州市5個未免疫弓形蟲疫苗的豬場母豬血清進行檢測，發現經產母豬的弓形蟲IgG 抗體陽性率普遍偏高，最高可達63.6%，而做過滅鼠措施或用磺胺類藥物預防的養殖場母豬弓形蟲IgG 抗體陽性率明顯低于未做過的養殖場（P＜0.05）。Qing 等[11]用間接血凝試驗（IHA）檢測山東省驢群的弓形蟲感染情況，結果顯示弓形蟲抗體陽性率為17%（213/1278）。雷雪珍[12]對2016—2018 年從廣東省多地收集的寵物犬貓和流浪犬貓血樣進行弓形蟲熒光PCR 和ELISA 檢測，發現寵物犬和寵物貓弓形蟲病原學陽性率分別為0.91%和2.28%，而流浪犬和流浪貓弓形蟲病原學陽性率分別為47.00%和40.00%，同時流浪犬貓的弓形蟲IgG 抗體陽性率顯著高于寵物犬貓。彭永喜[13]對2017—2018 年采集的沈陽地區犬、貓血清弓形蟲檢測發現，寵物犬、貓血清弓形蟲抗體陽性率分別為27.7%、20.5%，流浪貓為43.1%。王仁通[14]對大連市旅順口不同豬場的豬血清進行弓形蟲抗體檢測發現，樣本總體弓形蟲感染陽性率為 18.3%（87/476）。據調查[15]，人間弓形蟲的隱性感染普遍存在，在機體免疫力下降或缺陷時，弓形蟲可在機體內大量增殖，而后表現出一定的癥狀。但是動物弓形蟲病很少表現出獨有的特征性癥狀，很難通過臨床癥狀確診，因此該病的確診還需要更為準確的實驗室診斷技術。

1 病原學診斷

病原學診斷是最早建立的弓形蟲診斷方法，操作簡單，結果可靠，在20 世紀的弓形蟲病診斷中起到了重要作用。

1.1 組織學診斷

組織學診斷方法是對樣品染色后，通過顯微鏡觀察，找到病原體即為確認的一種方法，常用的染色方法包括吉姆薩染色、HE 染色、過氧化物酶-抗過氧化物（PAP）染色、PAS 染色等[16-17]。采用常用的染色方法，對組織包囊進行染色，可將寄生蟲與宿主細胞區分開，在鏡檢中發現速殖子或假包囊即可確診為弓形蟲感染，但發現包囊尚不能診斷為弓形蟲感染，還應結合臨床資料進行綜合分析[18]。組織學診斷方法存在很多不確定性因素，雖可確認檢出的蟲體，但未檢出時存在假陰性可能，這與未取到有蟲體的部位或者弓形蟲形態不夠典型有關，因此該方法存在主觀性以及檢出率低、耗時和易漏檢等缺點。隨著技術的發展，不同的染色方法也開始逐步得到擴展應用。宋光明[19]采用表面修飾Protein A 的磁性納米顆粒與弓形蟲的特異性抗體孵育制備成探針，經與待檢樣品震蕩、洗滌、重懸后在暗場顯微鏡下觀察。由于探針與蟲體表面特異性結合，暗場下衍射出可用顯微鏡觀察的金黃色亮光的蟲體輪廓，使得該方法的的最低檢測限可達到104個/mL，與普通PCR 方法的檢測能力相同，同時該方法檢測過程只需30 min，還可直接對血液進行檢測。磁性納米顆粒因為其良好的生物相容性和低毒性而被廣泛應用于生物醫學領域，但在獸醫診斷行業的應用還有待發展。

1.2 實驗動物接種法

接種法是將待檢樣品制備成液體，注入動物腹腔后取其腹腔液鏡檢速殖子的方法。這種方法以貓生物測定法作為金標準，一般在接種后5～15 d內收集貓糞鏡檢卵囊。而小鼠感染后一般會引起死亡，很少產生包囊，只可以檢測其腹水中的速殖子。接種法陽性檢出率高，但耗時、昂貴且需要大量實驗動物，不可大量應用于臨床，存在一定的生物安全風險，有時還可能引起病原擴散，甚至造成操作者自身感染。

隨著診斷技術的發展，病原學診斷方法由于耗時較長，無法滿足快速、高效、批量的檢測需求，在實驗室診斷方面的應用逐步減少。

2 分子生物學診斷

2.1 常規PCR 方法

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是一種被廣泛用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，可視為生物體外的特殊DNA 復制[20]。PCR 在反應體系中經過多個周期溫度循環，一般為30～35 個循環，使特定的DNA 片段數量可增加109倍。隨著PCR 技術的不斷完善與發展，它已被廣泛應用于分子生物學、食品學、法醫學、臨床醫學和獸醫寄生蟲學等各領域。

目前，多個目標基因可用于弓形蟲的PCR 檢測，其中應用最為廣泛的是529 bp 重復序列、B1基因以及P30基因[21]。王海燕等[22]以弓形體B1基因作為目標片段建立PCR 方法，其檢出限為10個弓形蟲速殖子DNA，且與寄生于豬體內的其他6 種常見微生物無交叉反應。崔平等[23]以弓形蟲P30基因為目標片段建立PCR 方法，其擴增結果為預期的484 bp 片段，檢出限為5 個弓形蟲速殖子，且與其他2 種寄生蟲無交叉反應。張云峰等[24]以弓形蟲IST1基因作為目標片段建立PCR方法，其擴增結果為預期的302 bp 片段，檢測限為7.81 pg/μL DNA。任科研等[25]以弓形蟲微線粒體MIC3基因作為目標片段建立PCR 方法，其擴增結果為預期的1 080 bp 片段，與微小隱孢子蟲、賈第蟲、旋毛蟲和球蟲等相關寄生蟲基因組無交叉反應，檢出限為10 個速殖子DNA。袁恒青等[26]對安徽省豬源弓形蟲的529 bp 重復序列進行了分析，發現其與GenBank 中的EF648169.1 株的同源性高達99.5%，且遺傳距離最為接近，適合作為弓形蟲病分子生物學診斷的目標基因。周志東[27]利用弓形蟲致密顆粒蛋白GRA14基因作為檢測的靶基因，建立了弓形蟲的特異PCR 檢測方法，檢出限為2.35 個弓形蟲速殖子，試驗比對優于以B1基因與529 bp 重復序列為目的片段的PCR 檢測方法；同時對26 個規模豬場不同類型樣品的PCR 檢測結果顯示，血液、廢料、尿液、組織、精液、廢水中均可檢出弓形蟲陽性，而血液樣品更適用于豬場弓形蟲病的臨床診斷和監測。

巢式PCR 是利用2 套引物對目標基因開展2輪擴增的方法，可在微量的DNA 模板中獲得高濃度和高純度的靶基因片段。但巢式PCR 技術缺點亦相對明顯，因需兩次擴增，使操作過程較為繁瑣，且對實驗室基礎有較高要求，較容易出現假陽性[28]。張瑩光等[29]利用529 bp 重復序列建立的巢式PCR檢測方法能特異性擴增出弓形蟲基因片段，檢測限為0.1 pg 的弓形蟲基因組DNA，敏感性是普通PCR 的100 倍。

2.2 環介導等溫擴增法（LAMP）

LAMP 是核酸擴增技術中的一種，被廣泛應用于各種領域，包括疫病診斷和生物學鑒定。該方法利用了BstDNA 聚合酶的置換活性，在等溫條件下，通過4 對引物識別目標基因的6 個區域[30]，敏感性高、特異性好，可以檢測病毒、細菌和真菌等病原體，也被廣泛應用于寄生蟲病診斷。Sotiriadou 等[31]依據弓形蟲的目標基因建立了檢測水樣中弓形蟲的LAMP 方法，檢出限為0.1 個弓形蟲滋養體DNA。Zhang 等[32]根據弓形蟲Rep529基因的保守區域建立弓形蟲LAMP 方法，檢出限為0.1 pg/mL，對疑似組織樣本的陽性檢出率為85.7%，比普通PCR（76.9%）高，證明LAMP 方法比PCR 方法更靈敏。隨后，有LAMP 應用于小鼠各種組織器官和患者血液樣本的弓形蟲感染檢測[33-34]。郭俊杰等[35]以弓形蟲529 bp 重復序列為目的片段建立的LAMP 技術可以檢測到弓形蟲微量DNA。宇芙蓉[36]根據弓形蟲WH6 株表面抗原1 的基因序列分別建立了LAMP 和PCR 檢測方法，發現LAMP 的敏感性為PCR 的100 倍；對已知背景的樣品進行檢測，發現LAMP 符合率為100%，而PCR 只有74%，兩種檢測方法結果相比具有統計學差異（P＜0.05）。Mirahmadi 等[37]用LAMP方法檢測了118 名精神分裂癥患者的血樣，發現弓形蟲檢出率為47.4%，比之前用巢式PCR檢測的（檢出率34.7%）要高。Sun[38]針對弓形蟲的529 bp 保守序列建立的LAMP 方法，檢測限達到單個速殖子或10 個重組質粒，檢出率為7.0%，比常規PCR方法（2.5%）高。LAMP可以在沒有精密儀器時快速、簡便開展檢測，其擴增產物可以通過熒光定量、電泳檢測，沉淀可以通過離心后肉眼觀察，不需要特殊的設備輔助，但由于該方法的高靈敏特點，受污染影響較大，因此在試驗過程中要嚴格做好質量控制，防止假陽性發生。

隨著各項技術的發展，不同檢測技術間的聯用也成為可能。薛楊繼[39]將LAMP 方法與測流試紙條（LFD）聯用，建立了LAMP-LFD 方法，檢測弓形蟲的529 bp 重復序列。通過LFD 試紙條讀取LAMP 反應結果，可在1 h 內最低檢出1 fg 弓形蟲全基因組。該方法靈敏度是PCR方法的100倍，同時實現了將分子檢測結果轉化成可視化的免疫檢測，直接通過試紙條讀取，簡化了LAMP 產物的鑒定過程。

2.3 熒光PCR 方法

目前，熒光PCR 技術是最常見的核酸檢測方法，其在PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR 進程，被廣泛應用于核酸檢測。2000 年，Lin 等[40]根據弓形蟲的B1基因首先建立了弓形蟲熒光PCR 方法，檢出限為0.05 個弓形蟲速殖子。該方法用于胎兒組織切片時的檢測陽性率與巢式PCR 一致，均為33.3%。Santoro 等[41]應用建立的熒光PCR 方法，對117頭野豬組織樣品進行弓形蟲檢測，發現78 頭野豬弓形蟲陽性，陽性率為44%。Lass 等[42]根據弓形蟲B1基因建立熒光PCR 方法，對食用蔬菜的弓形蟲污染情況進行檢測，發現陽性率為3.6%，這是首次對新鮮蔬菜進行弓形蟲調查。雷雪珍[12]以弓形蟲的529 bp 重復序列作為靶標建立了弓形蟲熒光PCR 方法，該方法穩定性好，R2在0.999 以上，檢出限為10 拷貝/μL，靈敏度是普通PCR 的100 倍以上。袁淑萍[43]等根據弓形蟲保守基因序列建立的豬弓形蟲實時熒光定量 PCR 檢測方法，在 101～107拷貝/μL 模板范圍內有很好的線性關系，檢出限可達101拷貝/μL。Khadijeh 等[44]用熒光PCR 方法和巢式PCR 方法對視網膜脈絡膜炎患者的弓形蟲B1基因進行檢測，結果顯示熒光PCR方法對B1基因的檢出率達90%，而巢式PCR 方法僅能檢出10%的病患，顯示熒光PCR 方法的敏感度高于巢式PCR 方法。同時也發現，外周血單核細胞比全血或血清更適合用于弓形蟲檢測。熒光PCR 方法在試驗過程不用開蓋，引物和探針相結合使用，特異性、敏感性較高，且不容易被污染，是目前應用最廣泛的核酸檢測技術。

2.4 數字PCR 方法

數字PCR 方法（digital PCR，dPCR）是在熒光PCR 基礎上發展而來的一種核酸絕對定量檢測方法，于1999 年首次由Bert Vogelstein 和Kenneth W.Kinzler 提出。該方法利用指數型函數和線性函數之間的轉化，對模板進行有限稀釋，根據熒光信號進行精確定量，被稱為第三代PCR 技術。Marino 等[45]用建立的數字PCR 方法檢測西西里島魚樣品中的弓形蟲，在來自12 種魚類的147 份樣本中，32 份被發現感染弓形蟲DNA；在16 份魚肉、表皮樣本和11 份腸道、鰓樣本中檢測出弓形蟲DNA，定量檢測的結果為5.7×104copies/mL。證實了魚類雖然不是弓形蟲的生物宿主，但是有可能受到弓形蟲卵囊的污染。其原因可能是未經處理的污水排放至江河，卵囊經河流流入海洋，而魚類充當了機械載體。數字PCR 方法可以做到樣品DNA 絕對定量，在低濃度樣品的檢測中更有優勢，并且擴增反應受酶抑制劑的影響更小。

分子生物學診斷方法雖然靈敏，但其檢測的主要對象是弓形蟲核酸，檢測結果受多個因素影響。張燁華等[46]選取了市售的6 種DNA 檢測試劑盒對含弓形蟲速殖子的豬膈肌樣品分別進行基因組DNA 提取，結果顯示不同方法提取的DNA用PCR 檢測的結果存在一定差異，以TIANamp Genomic DNA Kit 提取效果最好。研究也發現不同熒光PCR 的溫度升高和降低，對弱陽性樣本的檢出率有很大影響，如伯樂CFX96（熒光定量PCR 儀）在反應程序整體溫度調高2 ℃或調低1 ℃范圍內，有利于弱陽性樣本的檢出。因此，應用分子生物學方法對弓形蟲病原體進行檢測，需要針對不同的檢測對象不斷優化試驗條件，以確定最佳檢測方案。

3 免疫學診斷

3.1 染色試驗（DT）

染色試驗方法于20 世紀40 年代被首次提出，根據特異性抗體與蟲體輔助因子發生協同作用后蟲體胞漿對堿性美藍的親和力差異所設計，具有良好的敏感性和特異性。活滋養體與樣本中的抗體相作用，可加速滋養體發生變性，裂解蟲體表膜使蟲體表膜不被美藍所染，鏡檢觀測待檢樣品，50%不被著色者判為陽性[47]。但該檢測需要活的滋養體，在樣品保存、制備過程存在生物安全風險，因此使用受到很大限制。

3.2 間接血細胞凝集試驗（IHA）

該檢測方法以抗原抗體特異性結合和弓形蟲可溶性抗原致敏于紅細胞表面，出現肉眼可見的凝集現象的特性而建立，具有便捷、快速、經濟等優點，適合弓形蟲病的大規模篩選。全敏秀[48]用IHA 對湖南省 14 市（州）未進行弓形蟲疫苗免疫的雞群開展弓形蟲感染情況調查，發現湖南省弓形蟲總抗體陽性率為33.6%（457/1 360）。張克傳[49]對感染家兔用IHA 與其他檢測方法進行比較，結果顯示IHA 的檢測特異性為93.3%，敏感性為47.6%，總符合率為86.6%。向忠菊等[50]在弓形蟲血清學調查中應用IHA方法來檢測豬弓形蟲的感染情況，結果顯示IHA 方法的缺點是會與血清發生交叉反應，重復性較差，致敏紅細胞不穩定，易發生非特異凝集而使試劑難以標準化。

3.3 改良凝集試驗（MAT）

MAT 作為國際上公認的弓形蟲檢測“金標準”，具有準確率高、特異性好等優點。該方法于1997 年由Desmonts 首次建立[51]。Dubey 等[52]利用1 000 頭弓形蟲感染母豬的血清進行多種抗體檢測方法對比試驗，比對結果顯示MAT 在豬的弓形蟲隱性感染和發病檢測中均可行。佐思[53]用改良的MAT 試劑盒對91 份人血清、290 份豬血清、63 份小鼠血清進行檢測，并與ELISA 和進口MAT試劑盒進行比對，結果表明改良的MAT 試劑盒具有良好的特異性和敏感性，檢出率高于ELISA 試劑盒，準確率與進口的MAT 試劑盒相同，重復性好。楊娜等[54]應用MAT 與IHA 分別檢測了遼寧省不同地區不同動物的3 789 份血清，結果顯示MAT 法判定標準，敏感性、特異性和準確性都優于IHA。王仁通[55]用IHA 和MAT 對豬血清進行檢測，同時輔助進行PCR 判定，發現MAT 檢測結果與PCR 一致，而IHA 存在漏檢和假陽性情況。Fernandes 等[56]用IHA 和MAT 同時檢測了89 只家貓，發現IHA 的陽性檢出率為18%，MAT 為26%；IHA 的相對特異性達到了100%，但相對敏感性僅為70%。

3.4 間接熒光抗體試驗（IFAT）

IFAT 方法已在國外得到廣泛應用，是一種理想的弓形蟲抗體血清學檢測方法，現已開發出商業化試劑盒，但由于國內市場需求較小，間接熒光抗體試劑商業化程度明顯不足。孫希萌等[57]2008—2012 年對吉林和河北地區醫院和精神病院人群進行弓形蟲抗體檢測，發現IFAT 方法檢出的弓形蟲抗體陽性率為3.97%，與ELISA 的總體符合率僅為51.2%，因而在缺少標準參照的情況下，國產技術的穩定性還有待考量。盧致民等[58]研制的弓形蟲IFA 試劑盒與德國Viro-Immun 的試劑盒Youden指數分別為0.91 和0.98，敏感性和特異性間差異無統計學意義（P＞0.05），且自制試劑盒在4 ℃條件下保存期為6 個月。目前國內關于IFAT 的報道很少，但該方法在制片染色后即可通過顯微鏡觀察結果，同時操作較為方便而具有良好的開發推廣前景。

3.5 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

弓形蟲的ELISA 檢測方法在所有弓形蟲檢測技術中應用最普遍。羅才慶等[59]分別采用 IHA 和ELISA 方法檢測弓形蟲抗體并做對照試驗，研究發現IHA 和ELISA 方法均可用于豬弓形蟲病的血清學調查和診斷，而且兩種方法的差異并不顯著，符合率也較高。張靜[60]利用弓形蟲單克隆抗體B6G 建立了弓形蟲阻斷ELISA 檢測方法并對32 份豬血清進行檢測，發現陽性率與MAT 法一致，陽性符合率為87.5%，陰性符合率為100%，表明所建立的阻斷ELISA 方法能有效檢出臨床豬血清的弓形蟲抗體。李祎等[61]建立的循環抗原雙抗體夾心ELISA 方法，最低能夠檢測到血清中1.5 ng/mL GRA1 抗原。該方法與nPCR 相比具有較高的一致性，較市售商品化試劑盒更為準確可靠。Liyanage等[62]系統比較了現有的ELISA 分析方法，包括檢測試劑組分、檢測性能，涵蓋了4 個數據庫發表的57 篇文獻。在所調查的研究中，間接ELISA（占比95%）和自制ELISA（占比67%）是研究過程中最常見的檢測方法，在市售的試劑盒中法國IDvet 公司的“ID Screen?”多物種間接ELISA 試劑盒較為常見，因該試劑盒采用P30（SAG1）抗原和抗多組分偶聯物作為二抗，使其適用于反芻動物、豬、犬和貓等多物種的血清弓形蟲特異性抗體檢測，也可用于牛奶或肉汁的檢測。

雖然國內診斷試劑盒的質量與進口試劑盒有一定差距，但也可滿足豬場日常檢測工作需求。黃翠琴等[63]對80 份豬血清樣品進行檢測，比較了三種國產弓形蟲抗體檢測試劑盒的質量差異，結果顯示國產的弓形蟲IgG 抗體檢測試劑盒性能穩定，通過一致性檢驗三種試劑盒的Kappa 系數分別為0.57、0.75、0.64，檢測結果一致性表現為中高度，差異不顯著（P＞0.05），可用于豬場的日常檢測工作。

3.6 膠體金快速診斷技術

20 世紀80 年代末期，人們將膠體金標記技術、免疫檢測技術與層析分析技術結合發展建立了膠體金免疫診斷技術，由于其便捷、無污染、結果直觀等優點而得到了廣泛應用。盧愛桃等[64]采用ELISA 和膠體金免疫層析法（GICA）對呼和浩特市254 只犬貓進行弓形蟲抗體檢測，發現兩種方法無明顯差異。ELISA 方法雖更為靈敏，但實際操作時需要專業的儀器設備；GICA 方法則操作簡單，不需要實驗設備，易于推廣。張寧[65]以GRA6-GRA2 蛋白作為標記抗原制備了弓形蟲抗體檢測試紙條，對臨床289 份血清樣本進行檢測，將結果再與間接血凝試劑盒進行比對，發現試紙條的陽性檢出率為2.42%，而間接血凝試劑盒為2.07%，二者符合率為99.5%。張寧[66]用GRA6-GRA2 蛋白作為標記抗原制備膠體金試紙用于檢測貓弓形蟲抗體，發現膠體金試紙敏感性為1:256，用膠體金試紙與間接血凝試劑盒對289 份樣本血清進行檢測，發現二者符合率為99.5%。卓國榮[67]對280 份犬血清進行檢測，用間接血凝檢測和膠體金試紙檢出的陽性數分別為23 份（陽性率8.21%）、25 份（陽性率8.93%），結果表明兩種方法差異不顯著。但膠體金試紙操作簡便、快捷、靈活，適合于快速檢測。

4 展望

作為一種人獸共感染寄生蟲，弓形蟲不僅影響畜牧業，造成巨大經濟損失，還對公共衛生和動物源性食品安全構成嚴重威脅。由于該病的臨床特征不是很明顯，所以弓形蟲病診斷需要通過實驗室檢測才能確診。目前，免疫學檢測方法以ELISA和IHA 方法為主，已有較為成熟的商品化試劑盒或診斷試劑，這些方法在大規模檢測和流行病學調查中起到了很大的作用，為弓形蟲病防控提供了更為廣泛的技術支持。分子生物學方法近年來得到了長足發展，與傳統的病原學檢測方法相比，其速度、通量、特異性、敏感性各方面都有提升，相較于免疫學診斷，避免了獲得性免疫帶來的假陽性結果。雖然分子生物學診斷技術在部分領域仍有一定局限性，但高度的特異性、敏感性優點仍使其應用前景廣泛，其對弓形蟲病的流行病學調查、檢驗檢疫和臨床診斷十分重要，是未來弓形蟲病實驗室診斷的主要發展趨勢。