博來霉素誘導的肺纖維化形成不同時期模型大鼠血清代謝組學研究

陳葉青，仇雙逸，范欣生，胡方媛，周麗萍

(南京中醫藥大學中醫學院·中西醫結合學院，江蘇 南京 210023)

代謝組學作為一種組學檢測技術，能夠在特定條件如疾病或藥物治療情況下對生物體內的小分子代謝產物進行全面整體的分析[1]。氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)是一種常見的代謝組學分析方法，具有樣品制備方便、分析快速和重現性高等優勢[2]。目前被廣泛用于藥理學機制，藥物靶點篩選和發現疾病相關生物標志物等研究中[3-4]。

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一種間質性肺疾病，嚴重的肺纖維化疾病包括特發性肺纖維化會導致肺功能不可逆性下降，除肺移植外目前尚無治愈的方法[5]，常提示預后不良[6-7]。PF的發病機制尚不完全清楚，目前認為肺泡上皮細胞損傷是發病的開始，隨后成纖維細胞/肌成纖維細胞的轉分化[8]、活化和擴增，導致細胞外基質沉積，破壞正常的肺組織結構形成纖維化[9]。氣管內滴注博來霉素(bleomycin,BLM)復制的PF大鼠模型與人體發病情況較為接近，故該模型被廣泛用于對PF疾病的研究[10]。

目前，多見運用代謝組學方法進行診斷后的PF(特發性肺纖維化報道的較多)疾病生物標志物發現和鑒定研究，但該疾病發生發展過程中代謝物水平如何變化的尚無報道。在本實驗中，我們以氣管內滴注BLM復制PF大鼠模型，并利用GC-MS技術建立PF大鼠血清樣本的分析方法以及采集PF不同時期大鼠血清代謝指紋圖譜。通過多變量統計分析方法，主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)對PF不同時期大鼠血清代謝輪廓進行分析，篩選并鑒定差異代謝物以及挖掘代謝物參與的重要代謝途徑，從代謝組學角度探討PF疾病發生發展的機制。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級♂ SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司(許可證號：2017-0005)，注射用BLM購自瀚暉制藥有限公司(批號：19033911，規格：1.5萬BLM單位)，羥脯氨酸(HYP)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，甲氧胺、吡啶、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)、1,2-13C2肉豆蔻酸均購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 PF大鼠模型的復制及評價本實驗采用氣管內滴注BLM復制PF大鼠模型，通過組織病理學檢測評價PF大鼠模型。♂ SD大鼠50只，適應性飼養3 d，隨機分為空白對照組(Control)、模型7 d組(M7)、模型14 d組(M14)、模型21 d組(M21)、模型28 d組(M28)，每組各6～8只。PF模型組于d 1氣管滴注BLM(5 mg·kg-1)，各組大鼠分別于造模d 8、d 15、d 22、d 29從組織病理學(HE、Masson染色)、肺組織HYP含量方面對PF大鼠模型進行評價。

1.3 肺組織病理學觀察取固定于10%福爾馬林溶液的大鼠肺臟，脫水，石蠟包埋，切片，HE和Masson染色，在光學顯微鏡下進行病理學觀察。病變評估：根據病變由輕到重的程度標記為0分(基本正常)、0.5分(輕微)、1分(輕度)、2分(中度)、3分(重度)。

1.4 肺組織HYP含量測定精確稱取肺組織濕重100 mg于試管中，準確加入1 mL水解液制備組織勻漿，按說明書方法用堿水解法測定肺組織HYP含量。

1.5 樣本收集及預處理實驗開始后，于模型復制d 8、d 15、d 22、d 29肝門靜脈采血，收集血清，室溫靜置30 min后于4 ℃，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液于-80 ℃冷凍備用。同時取大鼠右肺，用液氮速凍后放入-80 ℃冷凍備用。將存放于-80 ℃的各組血清樣品置于冰上解凍，渦旋混勻后精密吸取50 μL，加入含有1,2-13C2肉豆蔻酸(12.5 mg·L-1)[11]的冰甲醇200 μL渦旋3 min，揮干2 h，再加入10 g·L-1甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液30 μL，混勻后于30 ℃、300 r·min-1振蕩1.5 h。加入BSTFA 30 μL，混勻，37 ℃、300 r·min-1振蕩0.5 h，18 000 r·min-1離心10 min，取上清50 μL進樣，供GC-MS分析得到代謝指紋圖譜。

1.6 GC-MS檢測運用GC-MS聯用儀(Trace 1310-TSQ 8000)進行血清樣本檢測，參數設置[12]：載氣為氦氣，流速為1.2 mL·min-1，采用分流模式，進樣口溫度250 ℃，分流比為20 ∶1，升溫程序：起始溫度60 ℃，保持1 min后，以20℃/min升至320 ℃后，保持5 min。EI源：離子源溫度280 ℃，離子傳輸線溫度250 ℃，電離能70 eV，采集范圍m/z 50～500。

2 結果

2.1 大鼠肺組織病理學改變與空白對照組比較，各模型組(M7、M14、M21、M28)大鼠隨著造模的進程，肺組織逐漸出現病變情況。HE染色顯示肺組織結構被破壞，肺泡壁有炎細胞浸潤，提示炎癥病變。Masson染色時肺泡壁和肺內支氣管、血管分支周圍間質有成纖維細胞增生并形成膠原纖維，呈藍綠色染色反應，提示纖維化病變。與空白對照組相比，模型M7組即造模d 8的模型大鼠肺組織肺泡壁和間質有炎細胞浸潤；造模d 15(M14)膠原纖維增生較7 d模型呈增加趨勢；造模22 d(M21)炎癥病變較7 d時呈減輕趨勢，膠原纖維增生較7 d時明顯增加；造模29 d(M28)炎癥病變較7 d模型明顯減輕，膠原纖維增生較7、14 d時顯著增加，見Fig 1、2，Tab 1。

Fig 1 HE stainning results of tissue sections of right lung in rats (×200)A: Control, B: M7, C: M14, D: M21, E: M28.

2.2 大鼠肺組織中HYP含量改變與空白對照組比較，各模型組大鼠肺組織中HYP含量逐漸明顯增加，造模d 22(M21)HYP含量最高，見Tab 1。

Tab 1 Comparison of HE staining, Masson staining score and HYP content in lung tissues in each group n=6)

2.3 多元統計分析對PF模型大鼠血清代謝輪廓分析，采用PCA無監督模式識別分析方法對血清樣本間差異進行直觀顯示。如Fig 3所示，在PCA模型中，各組大鼠模型的大鼠血清樣本與對照組有一定的區分。為進一步建立各組間的特異性差異模型，應用OPLS-DA表征組間真實差異，從OPLS-DA得分圖(Fig 4)可知，組間樣本區分顯著。

Fig 2 Masson stainning results of tissue sections of right lung in rats (×200)A: Control, B: M7, C: M14, D: M21, E: M28.

Fig 3 PCA 2D score of serum samples of control group and model group

Fig 4 OPLS-DA of serum metabolites

2.4 PF模型大鼠血清生物標記物識別運用GC-MS技術，M7組大鼠血清中共鑒定出9個潛在的差異性標記物(Tab 2)，與空白對照組比較，代謝物含量均明顯下降，其中亞油酸是其主要的差異性代謝物。

Tab 2 Identification of potential metabolites in serum of M7 rats by GC-MS

M14組大鼠血清中共鑒定出14個潛在的差異性標記物(Tab 3)，與空白對照組比較，代謝物含量明顯上升的6個，含量明顯下降的8個，其中亞油酸是其主要的差異性代謝物。

Tab 3 Identification of potential metabolites in serum of M14 rats by GC-MS

M21組大鼠血清中共鑒定出35個潛在的差異性標記物(Tab 4)，與空白對照組比較，代謝物含量明顯上升的9個，含量明顯下降的26個，其中苯丙氨酸、酪氨酸是主要的差異性代謝物。

Tab 4 Identification of potential metabolites in serum of M21 rats by GC-MS

M28組大鼠血清中共鑒定出13個潛在的差異性標記物(見Tab 5)，與空白對照組比較，代謝物含量明顯上升的6個，含量明顯下降的7個，其中亞油酸是該階段主要的差異性代謝物。

各階段血清中共有及特有的差異性代謝物見Fig 5。M7大鼠血清中共鑒定了9個潛在的差異性代謝物，M14血清中共鑒定了14個差異性代謝物，M21血清中共鑒定了35個差異性代謝物，M28血清

Tab 5 Identification of potential metabolites in serum of M28 rats by GC-MS

中共鑒定了13個差異性代謝物。其中M7與M14重疊差異性代謝物5個，分別是甘油、磷酸鹽、棕櫚油酸、亞油酸及油酸；M21與M28重疊差異性代謝物5個，分別是3-(3-羥基苯基)丙酸、丙氨酸、半乳糖酸、絲氨酸、亞油酸。M7特有的差異性代謝物2個：N-乙基甘氨酸、吲哚-3-乙酰胺，M14特有的差異性代謝物2個：異肌醇、花生四烯酸，M21特有的差異性代謝物24個，如脯氨酸、蛋氨酸、β-丙氨酸、異亮氨酸等，M28特有的差異性代謝物3個：谷胱甘肽、亮氨酸、肌醇。亞油酸是PF形成與發展各階段共有的差異性代謝物。

Fig 5 Overlapping analysis of differential metabolites in rat serum metabolomics of different formation and development stages

如Fig 6所示，根據重疊分析，進一步篩選出潛在的關鍵差異性代謝物，并根據其歸一化峰值在各時間段(或各模型組)的含量變化繪制柱狀分析圖。3-(3-羥苯基)丙酸的歸一化峰值在各模型組中總體呈上升的趨勢，在M21中最高；丙氨酸歸一化峰值在各模型組中總體呈下降的趨勢，在M21中最低；磷酸鹽的歸一化峰值在M7、M14 中顯著降低，在M21中顯著升高；亞油酸、棕櫚油酸、油酸的歸一化峰值在各模型組中降低。磷酸鹽、棕櫚油酸、油酸及亞油酸在肺纖維化早期含量變化明顯，3-(3-羥苯基)丙酸和丙氨酸在肺纖維化后期變化顯著。

Fig 6 Potential key differential metabolite normalized peak intensity in different time periods

2.5 代謝通路分析如Fig 7所示，對PF不同時期大鼠血清差異性代謝物相關代謝通路進行了分析，代謝途徑涉及脂質代謝、氨基酸代謝、其他氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔助因子和維生素的代謝，其中脂質代謝及氨基酸代謝異常是PF形成與發展過程中主要的代謝特征變化。各時期共有及特有的代謝通路見Fig 8，其中脂質代謝中的亞油酸代謝及其他氨基酸代謝中的谷胱甘肽代謝是不同時期的共同影響通路；花生四烯酸代謝是在肺纖維化早期，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、β-丙氨酸代謝、肌醇磷酸代謝等是在肺纖維化后期特有的代謝通路。

Fig 7 Metabolic pathway analysis of model differential metabolites

3 討論

近年來，PF的發病機制及疾病防治研究不斷深入，但是PF的治療藥物選擇有限，尚不能完全治愈。鑒于PF診斷相對困難，代謝組學生物標志物方面的研究為PF的診斷鑒別、預后評估提供了依據，但臨床實踐有待進一步考察。本文通過對PF模型大鼠血清代謝指紋、代謝輪廓、差異性代謝物及相關代謝通路的研究，從代謝組學角度探討了PF疾病形成與發展的機制。

Fig 8 Overlapping analysis of different metabolite-related metabolic pathways in rat serum of different formation and development stages

本文基于代謝組學技術對PF模型大鼠的血清代謝輪廓數據進行多變量分析，采用PCA、OPLS-DA等分析方法識別模型大鼠血清數據變化模式。由PCA分析結果可知，模型組和對照組均有聚集成群的趨勢；OPLS-DA結果顯示，在有監視的情況下，模型組和對照組聚集趨勢進一步增強，達到幾乎完全分離狀態，表明模型大鼠血清中代謝物種類及含量發生明顯變化。各模型組(M7、M14、M21、M28)分別篩選并鑒定了9種、14種、35種、13種顯著改變的代謝物，M21的差異性代謝物數量明顯高于其他組，這可能與其肺組織中HYP含量較高有關，提示BLM誘導肺纖維化引起內源性代謝物改變是肺內多種因素共同作用的結果。

在差異性代謝物識別過程中，我們發現了一些關鍵差異代謝物。在肺纖維早期，甘油、磷酸鹽水平明顯降低，隨著肺纖維化的形成，磷酸鹽水平明顯回升，3-(3-羥基苯基)丙酸水平明顯升高，丙氨酸、半乳糖酸、絲氨酸水平明顯降低。亞油酸、棕櫚油酸和油酸水平在肺纖維化形成與發展過程中呈降低趨勢，28 d較21 d有小幅度的降低，可能是機體的代償反應，但不排除組別之間的個體差異。Nambiar等[13]和Gaugg等[14]的研究發現脂質代謝紊亂及氨基酸變化異常會導致肺部損傷和肺纖維化，與本文研究結果類似。故甘油可能是PF早期炎癥階段的潛在生物標志物，3-(3-羥苯基)丙酸、丙氨酸、半乳糖酸、絲氨酸則可能是PF晚期肺纖維化階段的潛在生物標志物，磷酸、油酸、棕櫚油酸及亞油酸可能是PF疾病發生發展全過程的潛在標志物。