咪喹莫特誘導銀屑病模型小鼠T細胞免疫功能改變與性別的關系

楊 梅,唐彩紅,桂雨晴,陳鏡宇,魏 偉

(安徽醫科大學臨床藥理研究所,抗炎免疫藥物教育部重點實驗室,安徽抗炎免疫藥物協同創新中心,安徽 合肥 230032)

銀屑病是一種慢性自身免疫病,在其病理機制的研究和藥物的藥效學評價中,免疫系統的功能變化是重要的研究內容和評價依據。臨床上銀屑病的患病率在男女之間并無差異[1]。咪喹莫特(imiquimod,IMQ)誘導的小鼠銀屑病樣模型由于簡便易行,已成為實驗室研究中最常用的銀屑病動物模型,且該模型在病變特點上與銀屑病有諸多類似,因此，在銀屑病病理機制研究和藥物的藥效學評價中被廣泛應用。盡管課題組前期研究表明,IMQ誘導的銀屑病樣雌性小鼠模型和雄性小鼠模型中皮膚組織增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)與內披蛋白的表達沒有差異,但這個結論僅僅局限于動物模型中角質細胞增殖、分化的角度[2],然而此模型不同性別的小鼠的免疫功能是否會受到性別的影響,仍不清楚。闡明性別對該模型的影響,是保證研究結果的嚴謹、客觀的重要基礎。本研究從T細胞免疫細胞功能和角質細胞損傷兩個角度來探究IMQ誘導的銀屑病模型小鼠的免疫功能變化與性別之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物80只7～8周齡的BALB/c小鼠(雌雄各半),售于北京斯貝福生物科技有限公司[生產許可證號：SCXK(京)2019-0010],實驗中所使用的動物均飼養在安徽醫科大學臨床藥理研究所SPF動物實驗室。本實驗內容均通過安徽醫科大學臨床藥理研究所動物實驗倫理委員會批準。且本實驗所涉及的實驗方法均符合動物實驗的相關指南和規定。

1.2 藥物與試劑角蛋白1(keratin 1,K1)一抗(批號：00045116)、角蛋白10(keratin 10,K10)一抗(批號：14t1484)購自于Proteintech；Involucrin一抗(批號：52k4942)、IL-17一抗(批號：10k3643)、IFN-γ一抗(批號：11p5029)、IL-4一抗(批號：80w1874)、Ki67一抗(批號：40f5981)、PCNA一抗(批號：87a7182)、GAPDH一抗(批號：62u0922)購自于Affinity公司；EDTA抗原修復液Ph9.0(批號：19042401)、免疫組化通用型試劑盒(批號：2010D1217)購自于中杉金橋；ECL化學發光試劑購自于美國賽默飛(批號：TG269475)；IMQ乳膏購自于四川明欣制藥(批號：19070240)；凡士林乳膏購自于天津市博迪化工有限公司(批號：11021)；脫毛膏購自于冰王(批號：20041203)。

1.3 儀器Olympus倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)；Leica正置熒光顯微鏡(美國Leica)；低溫高速離心機(美國Sigma)；化學發光成像系統(美國GE公司)；十色流式細胞儀(美國Beckman Coulter有限公司)；1 mL玻璃勻漿器(廣州優博實驗器材有限公司)。

1.4 動物分組與銀屑病模型的建立BALB/c小鼠共80只(雌雄各半),隨機分為雌性正常組(N1),雄性正常組(N2),雌性模型組(M1)和雄性模型組(M2),各組小鼠數量均為20只。建模前4 d對小鼠進行背部脫毛(范圍2 cm×3 cm),為了防止脫毛處毛發再生,在第一次脫毛后設置2 d觀察期,后進行二次脫毛。正式造模當天,M1和M2組小鼠脫毛處均勻涂抹62.5 mg的IMQ乳膏,N1、N2組小鼠脫毛處則均勻涂抹相同劑量的凡士林乳膏作為對照,連續涂抹9 d。

1.5 小鼠背部造模處皮膚觀察為了記錄造模期間小鼠造模處皮膚的變化情況,從d 1開始每隔1 d進行拍照觀察,PASI評分對小鼠皮損皮膚的鱗屑、紅斑及增厚情況進行評分,三項評分之和為總評分。PASI評分標準設以下幾個等級：0～4分,依次評定為無癥狀，輕度，中度，重度，極重度,總分計算方式為3項指標得分之和(0～12分)。將每組的評分結果取平均值作評分變化曲線。

1.6 小鼠皮膚組織病理學觀察造模d 9,將小鼠眼球取血后處死。取皮損皮膚以及脾臟,1/4皮損皮膚用4%組織固定液常溫保存,其余組織-80 ℃保存備用。從固定液中取出皮膚,將取出的皮膚組織按照以下步驟處理：脫水、浸蠟與包埋、切片、蘇木精﹣伊紅染色,封片后置于通風櫥中通風干燥,后于顯微鏡下觀察,再隨機選擇3個視野進行拍照,之后用Image J識圖軟件測量角質層到基底層的垂直距離,以得到表皮厚度。

1.7 Western blot檢測增殖、分化蛋白的表達取凍存的皮膚組織,加入現配蛋白裂解液(蛋白裂解液 ∶PMSF ∶磷酸酶抑制=98 ∶1 ∶1)研磨,14 000 r·min-1離心10 min,吸取上層澄清液體,加入上樣緩沖液(5×),蛋白變性,隨后進行SDS凝膠電泳；轉膜；轉膜結束后將PVDF膜浸泡于TPBS(含有0.04%吐溫)配制的5%的脫脂牛奶中,于37 ℃搖床上封閉2 h；之后孵育一抗,4 ℃結合12 h以上；將相應來源的二抗加入TPBS配制的5%的脫脂牛奶中(二抗與TPBS按照1 ∶40 000比例配制),PBS洗PVDF膜,重復3遍；利用化學發光法顯影。

1.8 免疫組化檢測小鼠皮膚以及脾臟中CD4、IL-17、IL-4、IFN-γ的表達將石蠟切片脫蠟水化,通透(0.5%Triton),抗原修復液(pH 9.0)冷修復,過氧化物酶阻斷,3%BSA封閉30 min后,PBS洗3遍,將一抗滴在組織上,放于4 ℃冰箱孵育。12～24 h后回收一抗,室溫復溫30 min后,滴加反應增強液室溫反應10 min,PBS洗3遍,后滴加二抗,室溫放置20 min,使之充分反應,PBS洗3遍,DAB顯色劑染色1～2 min,蘇木精染核60 s,脫水,封片。待風干后,于顯微鏡下觀察CD4、IL-17、IL-4、IFN-γ的表達情況。

1.9 流式細胞術檢測小鼠脾臟中Th1、Th17細胞亞群小鼠眼球取血后處死,取2/3脾臟(其余1/3用作石蠟包埋,待用),包裹在開過高壓的200目紗網中,置于含有5 mL小鼠淋巴細胞分離液的無菌皿里,將脾臟浸于其中,利用無菌注射器的尾部進行按壓,至研磨充分。隨后隔著尼龍網用無菌巴氏吸管吸取淋巴細胞分離液轉移至15 mL離心管中,沿著試管壁緩慢加入預冷的RPMI 1640培基,直至總體積達7 mL,于4 ℃,850 g轉速條件下離心30 min。吸取淋巴細胞層,按照預先設計好的指標進行分組,除Th17需培養刺激外,其余分組細胞均可進行破膜、固定以及抗體的孵育,隨后即可上機檢測。

1.10 免疫熒光法檢測小鼠皮膚中K10以及Ki67的表達將預先準備好的石蠟切片脫蠟水化,隨后用0.5%Triton通透,抗原修復液(pH 9.0)冷修復,PBS洗滌,重復3遍,用3%的BSA封閉1 h后,PBS洗滌,重復3遍,將一抗滴于組織上放于4 ℃冰箱。12～24 h后回收一抗,滴加熒光二抗后放置于37 ℃搖床上,避光結合反應2 h。PBS洗3遍,滴加核酸染料(DAPI)室溫條件下孵育5 min,PBS洗3遍。在封片之前加入抗熒光淬滅劑。

2 結果

2.1 性別對IMQ誘導的小鼠銀屑病模型建立的影響

2.1.1小鼠皮膚皮損情況 N1、N2組小鼠在皮膚形態觀察期間皮膚均呈現細膩光滑的狀態,而M1、M2組小鼠分別與N1、N2組相比,使用IMQ的d 1就出現了少量銀屑與增厚,M1、M2組小鼠皮膚的明顯增厚和鱗屑均開始于d 3,并且紅斑所覆面積均有所擴大；d 5～7,鱗屑、增厚與紅斑進一步加重,在d 6增厚與紅斑達到高峰,M1與M2組小鼠分別在d 8和d 6達到鱗屑高峰期；d 9的皮膚鱗屑覆蓋面積,紅斑的顏色以及加厚程度均有所減輕,見Fig 1。

Fig 1 Skin morphological changes of mice induced

2.1.2小鼠皮膚PASI評分 根據PASI評分標準,IMQ誘導的M1、M2組小鼠皮損皮膚上的鱗屑,紅斑和增厚評分均在d 1～6升高(P<0.01),d 7開始下降(Fig 2A-C)。總分計算公式為：總分=鱗屑評分+增厚評分+紅斑評分(Fig 2D),IMQ誘導的M1、M2組小鼠PASI評分總分分別與N1、N2組小鼠總分相比,在d 1～6均升高(P<0.01),而M1和M2組小鼠之間PASI評分總分結果之間的差異無統計學意義,見Fig 2D。

A：scales; B：erythema; C： thickness; D： total scores. N1：female normal group; N2：male normal group; M1：female model group; M2：male model group. **P<0.01 vs female normal group; ##P<0.01 vs male normal group.

2.1.3小鼠皮膚組織病理學改變 利用HE染色法觀察小鼠皮損皮膚病理改變,與N1、N2組相比,M1、M2組小鼠顆粒層及棘層增厚明顯,且棘突出現明顯的不規則延長,同時,角質層還出現了明顯的分化不全和過度角化現象(分別用箭頭和星號標記),并且真皮層還出現了嚴重的炎性細胞浸潤。M1、M2組小鼠皮損處表皮厚度測量結果分別與N1、N2組小鼠表皮厚度測量結果相比,厚度差異有統計學意義(P<0.01)。而M1、M2組小鼠之間表皮厚度的測量結果差異不存在統計學意義,見Fig 3。

Fig 3 Histopathological changes of mice skin

2.1.4皮損組織中角質細胞增殖蛋白的表達 M1、M2組小鼠皮損皮膚中PCNA蛋白表達水平相對于N1、N2組來說明顯增加,且表達水平差異存在統計學意義(P<0.05,P<0.01)；而M1、M2組之間的PCNA蛋白水平差異不存在統計學意義,見Fig 4A-B。M1、M2組小鼠皮膚中細胞增殖標記蛋白Ki67表達水平較N1、N2組來說增加,且熒光分布范圍更廣,表達相對集中于棘層、基底層及以下,見Fig 5A。計算Ki67/DAPI數量后,結果顯示,M1、M2組皮膚中Ki67細胞的相對表達數量明顯高于N1、N2組,差異存在統計學意義(P<0.01),且此指標在M1、M2組之間的差異不存在統計學意義,見Fig 5C。這些結果提示,M1、M2組小鼠皮損處的角質形成細胞均表現為過度增殖,且M1、M2組之間皮損處的角質形成細胞增殖水平差異不存在統計學意義。

Fig 4 The protein levels of PCNA, K10, K1, and involucrin in skin n=3)

2.1.5皮損組織中角質細胞分化蛋白的表達 相對于N1、N2組來說,K10、K1以及involucrin在M1、M2組小鼠皮膚中的表達均減少(P<0.05,P<0.01),而M1、M2組之間這3個分化蛋白表達水平的差異無統計學意義(P>0.05),見Fig 4A-B。N1、N2組小鼠K10熒光強度均明顯高于M1、M2組(P<0.05),且熒光集中在顆粒層及以上部位, 見Fig 5B。這些結果提示,M1、M2組皮損處角質細胞均出現異常分化,且M1、M2之間的差異無統計學意義。

Fig 5 Expression of K10 and Ki67 in skin tissues detected by immunofluorescence assay(×200) n=5)

2.2 性別對IMQ誘導的小鼠銀屑病樣模型T細胞免疫功能的影響

2.2.1小鼠脾臟指數 分別與N1、N2組小鼠相比,M1、M2組小鼠脾臟體積明顯增大,有明顯的充血,脾臟指數明顯增大,且差異具有統計學意義(P<0.01),并且M1、M2組之間的脾臟指數差異并無統計學意義,見Fig 6。

2.2.2皮損組織中CD4、IFN-γ、IL-4、IL-17的表達 M1、M2組分別與N1、N2組相比,模型組小鼠皮膚中CD4、IFN-γ以及IL-17表達水平均明顯增加(P<0.05,P<0.01),IL-4明顯減少(P<0.01),而M1、M2組之間的差異無統計學意義(P>0.05),見Fig 7。

Fig 7 Expression of CD4, IFN-γ, IL-4, and IL-17 in skin tissues detected by immunohistochemical n=5)

2.2.3脾臟組織中CD4、IFN-γ、IL-4、IL-17的表達M1、M2組分別與N1、N2組相比,M1、M2組小鼠脾臟組織中CD4、IFN-γ以及IL-17均明顯增多(P<0.01),IL-4明顯減少(P<0.01),而M1、M2組之間差異無統計學意義,見Fig 8。

Fig 8 Expression of CD4, IFN-γ, IL-4 and IL-17 in spleen detected by immunohistochemical n=5)

2.2.4脾臟中Th17、Th1細胞亞群比例 M1、M2組小鼠脾臟中Th1和Th17細胞比例明顯高于N1、N2組小鼠(P<0.05,P<0.01),M1、M2組小鼠之間差異均無統計學意義,見Fig 9。

Fig 9 Proportion of Th17 and Th1 cells in n=10)

3 討論

很多自身免疫病如硬皮病、狼瘡以及類風濕關節炎等在女性人群中更加具有易感性[3-4]。銀屑病作為一種受多種因素相互作用引起的慢性鱗屑性自身免疫病,可以影響各個年齡段的男性和女性[5-6]。

激活的T細胞在選擇性凋亡后,會出現銀屑病斑塊消退的現象,表明T細胞在銀屑病進程中可能起著決定性作用[7]。研究表明,將從銀屑病患者身上獲得的CD4+而非CD8+T細胞注射到人非皮損皮膚中后,將該皮膚移植到免疫缺陷小鼠模型上,會誘發銀屑病[8]。T細胞活化與IFN-γ、IL-17A和TNF-α等的分泌有關,這些因子會影響Th1/Th2穩態、Th17/Treg平衡和IL-23/Th17軸來影響銀屑病的發生、發展[9]。銀屑病皮膚中IL-17的激活和表達增加會致使表皮角質形成細胞過度活化增殖,還會促使炎性細胞及因子被招募到皮膚中,使銀屑病加快或持續嚴重化,干擾T細胞的募集或阻斷IL-17A或IL-17受體，可以有效緩解銀屑病癥狀[10-13]。本研究發現,IMQ誘導的銀屑病雄性和雌性小鼠脾臟中Th1和Th17細胞比例增加；皮損處有大量CD4+T浸潤,且IFN-γ以及IL-17增多；而雌、雄模型組小鼠之間差異均無統計學意義。這些結果提示,IMQ誘導的銀屑病小鼠出現皮膚局部以及全身T細胞異常活化；性別對IMQ誘導的銀屑病小鼠的皮膚局部以及全身T細胞免疫功能的活化均沒有影響。

Ki67為一種核蛋白,活動期(G1、S、G2、M期)表達較多,靜止期(G0期)一般不表達或表達較低,PCNA是一種與DNA復制、修復和細胞周期進程有關的代謝蛋白,在細胞復制過程中發揮關鍵作用[14-16]。K1和K10被認為是終末分化的最早標記物,是分化的角質形成細胞最先表達的蛋白之一。同時,involucrin是交聯膜的可溶性蛋白前體,作為一種分化標志物位于棘狀細胞的最后一層和顆粒層中[17]。我們的研究進行了PASI評分、病理組織分析以及角質細胞增殖和分化的標志性分子研究,發現就模型的建立來說,IMQ誘導的不同性別的銀屑病樣小鼠模型中角質細胞的增殖和分化的變化是沒有差異的。

綜上所述,本研究發現性別對IMQ誘導的銀屑病小鼠模型的建立,以及皮膚局部和全身T細胞免疫功能的活化均沒有影響,在實驗研究中可以單用一個性別的小鼠，也可以雌、雄小鼠兼用。